5种培养基对蛋白核小球藻生长及其产物合成的影响

梁志波，刘平英，周有彩，陈必链，2，何勇锦，2

(1.福建师范大学生命科学学院，福建 福州 350117;2.福建师范大学工业微生物教育部工程研究中心，福建 福州 350117)

小球藻是地球上最早以光合自养营养方式繁殖的单细胞微生物之一，其细胞内富含蛋白质、多糖、不饱和脂肪酸等生物活性物质．这些活性物质具有抗氧化、抗病毒、抑菌活性以及提高人体免疫力等多种功效[1]．部分小球藻在黑暗条件下，能够利用有机碳源进行异养生长[2-3]．与光自养模式相比，小球藻在异养条件下，可以显著提高细胞的生长速率和密度[4]．影响小球藻异养生长特性的主要因素有[5]：藻种自身异养生长能力；培养基组成；培养环境．

当前，有多种培养基配方已广泛运用于小球藻的异养培养，以获得蛋白质、淀粉、油脂、色素等目标产物[6]．Xie等[7]使用SE培养基，评估了在异养培养条件下，小球藻FACHB-8产蛋白质的能力，结果表明，蛋白质含量最高可达44.3%．Xiao等[8]以HA-SK为初始培养基，通过调控培养基的氮浓度，提高了异养小球藻MBFJNU-17的蛋白质含量，达到60%左右．Yun等[9]以含有不同葡萄糖浓度的BG11培养基，评估了3株小球藻(KNUA104、KNUA114和KNUA122)，在异养培养条件下有关于生物量产率、油脂、蛋白质和色素的含量变化．Liu等[10]使用Basal培养基，并添加不同比例的含油酵母，培养2株小球藻(Chlorellapyrenoidosa15-2070和ChlorellavulgarisNIES-227)，以提高生物量和脂质产量的潜力．Rosenberg等[11]使用BBM培养基，比较分析3株小球藻(ChlorellasorokinianaUTEX 1230、ChlorellavulgarisUTEX 265 和ChlorellaprotothecoidesUTEX 411)光合自养和异养培养中的生长速率、生物量产量和脂质生产力．

不同的小球藻具有各自独特的生长和产物合成特性．在异养培养过程中，不同培养基的营养元素种类和浓度是影响小球藻生长和目标产物合成的主要因素．本文就实验室分离纯化的一株蛋白核小球藻CP-FJ9，研究了在异养培养模式下，不同培养基(SE、HA-SK、BG11、Basal和BBM)对小球藻CP-FJ9细胞生长和产物合成的影响；同时，使用HA-SK培养基在10-L发酵罐中异养培养小球藻CP-FJ9，进一步评估小球藻CP-FJ9生长和蛋白质积累能力，旨在为开发富含蛋白质藻粉原料提供理论基础．

1 材料与方法

1.1 藻种与仪器

1.1.1 藻种

蛋白核小球藻ChlorellapyrenoidosaCP-FJ9，由本实验室从福建省闽侯县溪源江分离获得[12]，保存于含5 g·L-1葡萄糖和18 g·L-1琼脂的BG11培养基中．

1.1.2 仪器

10 L发酵罐-FUS10-1853-2(上海国强生化工程装备有限公司)；高速冷冻离心机-TG16-WS(湖南湘仪实验仪器开发有限公司)；精密分析天平-BS224S(北京赛多利斯系统仪器有限公司)；电热恒温干燥箱-DHG-9070A(上海一恒科技有限公司)；紫外分光光度计-F-4600(日立高新有限公司)；生物传感分析仪-SBA-40E(山东省科学院生物研究所)；水浴锅-DK-S-24(上海精宏实验设备有限公司)；高温蒸汽灭菌锅-HVE-50(中原机械有限公司)； 超纯水机-FBZ2002-UP-P(青岛富勒姆科技有限公司)；超净工作台-SW-CJ-2G(苏州净化有限公司)；pH计-ST3100(奥豪斯仪器有限公司)等．

1.2 实验方法

1.2.1 种子培养

从BG11琼脂斜面挑取适量小球藻CP-FJ9藻细胞，转接于含10 g·L-1葡萄糖的BG11培养基中，放置恒温振荡摇床培养，摇床温度28 ℃，转速150 r·min-1，遮光培养7 d．

1.2.2 培养基

(1)5种不同培养基的营养成分组成如表1所示．

表1 不同培养基的营养成分组成Tab.1 The composition of different culture media

(2)土壤提取液制备：取未施过肥的花园土0.5 kg置于烧杯或三角瓶中，加入蒸馏水1 L，瓶口透气塞封口，在水浴中沸水加热2 h，冷却至室温，在无菌条件下过滤，取上清液，将灭菌蒸馏水加入上清液至总体积1 L，4 ℃保存[7]．

1.2.3 微藻培养

将培养至对数生长期的小球藻CP-FJ9，无菌离心(5 000 r·min-1，5 min)，弃上清，使用适量无菌水，洗涤3次，然后取适量藻体，分别转接到SE、HA-SK、BG11、Basal和BBM培养基中，接种质量浓度约为0.3 g·L-1，每组实验设置3个平行．培养条件设置摇床温度28 ℃，转速150 r·min-1，黑暗培养10 d．

1.2.4 10 L发酵罐培养

应用10 L发酵罐对小球藻CP-FJ9进行分批发酵培养．使用HA-SK培养基，发酵罐装液量控制在7 L，初始小球藻CP-FJ9生物量为0.4 g·L-1，通气量为0.84 m3·h-1．当藻细胞停止生长后，发酵结束．测定藻生长过程的生物量、蛋白质含量以及培养基葡萄糖和尿素的浓度．

1.3 分析测定

1.3.1 碳源和氮源的测定

采用生物传感分析仪SBA-40E测定培养基中葡萄糖的浓度．采用水中硝酸盐氮的测定方法(紫外分光光度方法)测定培养基中NO3--N的浓度[13]．采用血尿素氮试剂盒(北京博克斯生物科技有限公司)测定尿素氮的浓度．

底物的微藻生物量得率(YX/G，g·g-1)，由以下公式估计：

(1)

其中，ρE和tE分别为试验结束时微藻干生物量(g·L-1)和时间(d)；ρ0和t0分别为第0天的初始干生物量(g·L-1)和时间(d)．

1.3.2 培养基pH测定

采用实验室pH计ST3100测定pH．

1.3.3 生物量及比生长速率的测定

采用细胞干重法测定微藻生物量．收集1 mL微藻培养样品并离心(8 000 r·min-1，10 min)以收集小球藻CP-FJ9细胞，微藻细胞用蒸馏水离心洗涤3次，并转移至预先烘干称质量的玻璃平板，放置80 ℃烘箱干燥至恒质量，称质量并记录数据．其中，微藻细胞的比生长速率μ由公式计算：

(2)

式中，ρ2为t2时间的微藻生物量；ρ1为t1时间的微藻生物量．

1.3.4 细胞生物大分子的测定

微藻生物质的碳水化合物含量采用苯酚-硫酸法[12]进行测定．蛋白质含量采用凯氏定氮法(GB 5009.5-2016)分析．油脂含量采用氯仿-甲醇法进行测定[14]．

1.4 统计分析

摇瓶和发酵罐实验均重复3次．实验数据表示为平均值(N=3)±标准偏差，采用Microsoft Excel 2010和Origin 8.5软件进行分析，通过单因素方差分析 (ANOVA)检查平均值之间的显着差异(P<0.05)．

2 结果与讨论

2.1 不同培养基中培养小球藻CP-FJ9的生长情况

SE、Basal、HA-SK、BG11和BBM 5种不同培养基对小球藻CP-FJ9生物量的影响见图1a．小球藻CP-FJ9分别在SE、Basal、HA-SK、BG11和BBM培养基中所得最终的生物量为1.55、12.93、11.47、3.97、0.62 g·L-1．桂林等[15]以Basal为基础培养基，异养培养蛋白核小球藻15-2070，得到最终生物量约13 g·L-1．Bouyam等[16]使用Basal培养基异养培养小球藻TISTR 8990，获得最高生物量10.90 g·L-1．在本研究中，小球藻 CP-FJ9在Basal培养基中最终生物量与桂林等研究获得生物量水平相当，高于Bouyam等研究结果．这种现象可能与小球藻种类以及培养条件不同有关[17-18]．

小球藻CP-FJ9在生长过程的比生长速率结果见表2．在5种培养基中，小球藻CP-FJ9在Basal培养基中有最高比生长速率为0.64 d-1，其次为HA-SK实验组(0.51 d-1)，再次为BG11培养基(0.31 d-1)．然而，小球藻CP-FJ9在SE和BBM培养基中所得的比生长速率仅有0.10 d-1和0.02 d-1，显著低于其他培养基．实验结果说明，小球藻CP-FJ9在不同培养基中所表现的生长性能不同(图1a)，进而导致了其比生长速率存在明显差异．因此就生长能力方面，Basal培养基培养小球藻CP-FJ9，可获得较多的生物量．

2.2 小球藻CP-FJ9对培养基碳源和氮源的消耗

图1b显示了小球藻CP-FJ9培养过程中葡萄糖的消耗情况．小球藻CP-FJ9可以完全消耗Basal和HA-SK培养基中的葡萄糖．在葡萄糖质量浓度分别为20、15、10 g·L-1的BG11、BBM、SE培养基中，小球藻CP-FJ9并没有充分利用葡萄糖，葡萄糖利用率分别为65.69%、4.11%、43.55%．底物(葡萄糖)的微藻生物量得率YX/G，结果见表2．由表2可知，小球藻CP-FJ9在Basal和HA-SK培养基中，其YX/G最高，分别为0.33、0.30 g·g-1，没有显著性差异．而在BG11、BBM、SE培养基中，小球藻CP-FJ9的YX/G仅为 0.27、0.12、0.27 g·g-1．这可能是在这3种培养基中，小球藻CP-FJ9将较多的能量用于呼吸代谢作用[19]．因此就葡萄糖对小球藻CP-FJ9细胞生物量的转换率方面， Basal和HA-SK培养基最适合．

表2 不同培养基对小球藻CP-FJ9比生长速率及底物的微藻生物量得率的影响Tab.2 Effects of different media on specific growth rate of Chlorella pyrenoidosa CP-FJ9 and microalgae biomass yield of substrate

图1c为小球藻CP-FJ9对5种培养基氮源的利用情况．小球藻在Basal和HA-SK 利用的氮最多，分别利用1.02 g·L-1氮(利用率97.77%)和1.28 g·L-1的氮(利用率69.51%)．尽管小球藻在HA-SK培养基的生物量比Basal培养基中的低，但是氮的利用量更高，可能原因是小球藻在HA-SK培养基中可以利用更多的氮以合成更多的含氮量较高的产物．在SE培养基中，微藻利用0.04 g·L-1(利用率100%)，然而，在BG11和BBM培养基中，小球藻CP-FJ9未能较好利用氮源，经培养10 d后，小球藻培养体系中氮还分别剩余0.20、0.01 g·L-1．这可能原因是， BG11和BBM 2种培养基未能促使小球藻CP-FJ9优良生长，导致细胞对培养基中的碳源和氮源利用能力较差．

图1 不同培养基对小球藻CP-FJ9的影响Fig.1 Effects of different media on Chlorella pyrenoidosa CP-FJ9

2.3 不同培养基中培养小球藻CP-FJ9的pH变化情况

pH是微藻生长过程中重要的影响因子之一．小球藻异养培养过程中，培养基pH过高或过低，会影响小球藻生长代谢，例如，影响细胞对有机碳源的吸收和转化效率，同时会改变细胞膜的通透性，影响一些离子的吸收、代谢物和毒素的排放、某些关键酶的活性，造成细胞生长缓慢，甚至死亡[1]．图1d显示了小球藻CP-FJ9在不同培养基培养过程pH的变化情况．由图1d可知，以尿素为氮源的HA-SK培养基中培养小球藻CP-FJ9，pH的变化幅度小，总体较为稳定．周有彩等[20]利用HA-SK培养基培养小球藻MBFJNU-17，培养过程中引发的pH波动较小．本实验中，以KNO3或NaNO3为氮源的Basal、BG11和SE培养基培养小球藻，pH都呈上升趋势．可能原因是，微藻在对氮源进行吸收利用后，大量的阳离子残留于培养液中生成 K2CO3或Na2CO3等一类弱酸强碱盐，促使pH升高．以NaNO3为唯一氮源的BBM培养基中，pH从初始的6.11降至5.30，随后保持不变，可能是因为小球藻CP-FJ9在BBM培养基中生长缓慢，NaNO3利用率低，在利用部分葡萄糖后，产生酸性物质，导致培养基pH变化[21]．因此就培养pH调控方面，可以选择HA-SK培养基作为小球藻CP-FJ9的异养培养基，以避免规模化应用过程中繁琐的pH调控．

2.4 不同培养基对小球藻CP-FJ9主要组分的影响

小球藻CP-FJ9在5种培养基中培养结束后，对收集生物量测定蛋白质、碳水化合物和油脂含量，其结果见如图2．小球藻CP-FJ9在SE培养基中有最高的碳水化合物含量为47.44%，在HA-SK培养中有最高的蛋白质含量为44.82%，在BBM中有最高的油脂含量为37.08%．值得注意的是，在SE培养基中，培养小球藻CP-FJ9至第2 天，培养基中的氮源已全部耗完，在缺氮条件下，小球藻CP-FJ9更倾向于合成碳水化合物．相关研究表明，氮源消耗完后，微藻可以通过调控蛋白质的碳代谢通量，以促进碳水化合物或油脂生物合成[22]．Xiao等[8]研究发现，小球藻Chlorellasp.MBFJNU-17在高碳低氮条件下，与氮源消耗和氨基酸合成的相关酶基因下调，蛋白质含量降低，淀粉生物合成基因的表达程度上调，碳水化合物快速积累(55.01%)．

图2 不同培养基对小球藻CP-FJ9理化成分的影响Fig.2 Effects of different media on physical and chemical composition of Chlorella pyrenoidosa CP-FJ9

通过对比5种不同培养基配方，营养元素相对较为丰富的 HA-SK和Basal培养基，培养得到的小球藻CP-FJ9蛋白质含量相对较高；而氮源浓度低，碳氮比高的SE、BG11和BBM培养基，小球藻CP-FJ9所合成碳水化合物和油脂含量较高．因此选择碳源和氮源浓度高，营养元素含量丰富的培养基，例如HA-SK培养基，在一定程度上，不仅能够促进小球藻CP-FJ9生长，而且有利于提高蛋白质含量．

本实验在异养模式下，采用SE、Basal、HA-SK、BG11和BBM 5种培养基培养小球藻CP-FJ9，经10 d异养发酵后，小球藻CP-FJ9在 Basal培养基中可获得最高生物量(12.93 g·L-1)，在HA-SK培养基中最有利于蛋白质合成(44.82%)．将小球藻CP-FJ9在5种培养基异养培养的生物量和主要产物含量及产量，与已报道异养小球藻藻株的研究结果进行了比较．由表3可知，小球藻CP-FJ9在Basal培养基中获得的最高生物量为12.93 g·L-1，低于魏东等[23]培养蛋白核小球藻Chlorellapyrenoidosa获得的生物量，可能原因是所用培养基的碳源浓度不同以及藻的种间差异．小球藻CP-FJ9在HA-SK培养基中获得的生物量和蛋白质含量稍低于周有彩等[20]的报道．周有彩等优化了HA-SK培养基，提升了藻生物量和蛋白质含量．因此今后的工作还可以根据小球藻CP-FJ9的特性进一步优化所用培养基，以提高藻生物量和蛋白质的生产效率．

表3 不同小球藻在异养条件下生物量和主要产物含量及产量Tab.3 The biomass, main product content and yield of different Chlorella species under heterotrophic conditions

2.5 10 L发酵罐异养培养小球藻CP-FJ9

用10 L发酵罐进一步评估小球藻CP-FJ9在HA-SK培养基中生产富含蛋白质生物质的潜力．小球藻CP-FJ9在HA-SK 培养基中进行分批发酵，生物量、葡萄糖和尿素消耗以及细胞蛋白质含量的结果见图3．小球藻CP-FJ9在0～24 h处于延滞期，24 h后生物量快速生长，在48 h时达到最大值22.85 g·L-1，随后保持相对稳定．10 L发酵罐培养所得的小球藻最高生物量高于摇瓶获得的值(12.90 g·L-1)．这可能原因是，与 250 mL 摇瓶相比，10 L发酵罐有更好的溶氧性能，能有效促进微藻生长，也提高了细胞对葡萄糖和尿素的吸收转化．从图3可以看到，在 10 L发酵罐中培养的小球藻CP-FJ9能够在72 h内完全消耗完葡萄糖和尿素．培养结束时，小球藻CP-FJ9最终生物量为20.05 g·L-1，细胞蛋白质含量为49.88%．

图3 小球藻CP-FJ9在10 L 发酵罐中生长和代谢情况Fig.3 Growth and metabolism of Chlorella pyrenoidosa CP-FJ9 in 10 L fermenter

3 结论

本文研究了SE、Basal、HA-SK、BG11和BBM培养基对小球藻CP-FJ9生长和产物合成的影响．通过对比，小球藻CP-FJ9在Basal培养基中可获得最大生物量12.93 g·L-1，在HA-SK培养基中蛋白质产量最高为5.14 g·L-1，在SE培养基中碳水化合物的含量最高为47.44%，在BBM培养基中，可获得最大油脂含量为37.08%．利用10 L发酵罐验证了HA-SK培养基异养培养小球藻CP-FJ9，得到结果最终生物量为20.05 g·L-1，蛋白质含量为49.06%．结果表明，小球藻CP-FJ9是一株有潜力用于开发富含蛋白质的优良藻种．