绿豆种子组织培养的几种灭菌方法

胡亚群，周琰琰，薛冬，韦雅雯，闫强，袁星星，陈新*

(1.南京农业大学 生命科学学院，江苏 南京 210095；2.江苏省农业科学院经济作物研究所 江苏省高效园艺作物遗传改良重点实验室，江苏 南京 210014)

绿豆[Vignaradiata(L．)R．Wilczek]属于豆科(Leguminosae)、蝶形花亚科(Papilionaceae)、菜豆族(Phaseoleae)、豇豆属(VignaSavi)作物，是主要的食用豆类之一[1]。中国绿豆种植的历史悠久，种质资源丰富，栽培面积较大，是绿豆的起源中心之一[2]。绿豆的营养价值丰富，是粮菜兼用、医食同源的经济作物，因蛋白含量高、脂肪含量低而受到人们的广泛喜爱[3]。绿豆具有生育期短、耐干旱、耐瘠薄及适应性强等特性，在农业发展和土地养护方面起到重要作用[4]。

转基因可以有效地选育抗病、抗虫及抗除草剂的种质资源，而转基因育种的关键是组织培养技术，对种子的灭菌是组织培养的关键前提，灭菌效果关系到种子萌发、后续幼苗的长势及分化。对种子的灭菌不仅要杀死表面的微生物，还要减少灭菌剂对种子本身的伤害，以求得到污染率低、成活率高的外植体[5]。王栋等[6]研究发现，梭梭种子最佳灭菌方法为75%乙醇5 min+0.1%氯化汞8 min。王春梅等[7-8]对苜蓿种子灭菌的研究发现，0.1%氯化汞+10%次氯酸钠+70%乙醇和10%次氯酸钠+70%乙醇+1∶15洁尔灭的灭菌方法污染率最低，且后一种方法对操作人员相对安全。高雨灵等[9-11]研究证明，0.1%氯化汞是木棉种子的优良灭菌剂[8]。但以上灭菌手段中所采用的氯化汞属于剧毒试剂，对环境及人体有危害。

开发高效且环境友好的种子灭菌方式对组织培养有重要意义，很多研究者也进行了积极的探索。侯金艳等[12]研究表明，次氯酸钠溶液与超声复合处理为黄连木种子灭菌的理想方法。王一珂等[13]以烟草种子为材料，研究过碳酸钠对种子的灭菌效果及对无菌苗生长的影响，获得了较好的灭菌效果。于倩等[14]研究表明，使用75%乙醇60 s、50%次氯酸钠溶液30 min对白刺种子进行处理，可获得最好的灭菌效果。陈华涛等[15]研究表明，75%乙醇1 min+5%次氯酸钠30 min的灭菌方法能有效降低污染率，小豆种子的萌发率也较高，综合效果最佳。刘海坤等[16]研究表明，氯气对大豆种子灭菌效果非常理想。

为了探究组织培养体系中绿豆种子灭菌的最佳方式，本研究利用75%乙醇、30%次氯酸钠、4%过碳酸钠和氯气作为灭菌剂，组合搭配8种灭菌方式对绿豆种子进行灭菌处理。对异常株数、萌发率、污染率及丛生芽分化率等指标进行统计分析及综合评价，旨在选出适宜的灭菌剂及灭菌时间。

1 材料与方法

1.1 试验材料

绿豆品种为冀绿7号，由江苏省农业科学院经济作物研究所保存。使用基本培养基(MS培养基)用于绿豆萌发、生长情况调查及制备外植体前的萌发。绿豆分化使用B5+抗生素作为分化培养基。

1.2 试验方法

1.2.1 种子处理

选取健康、饱满、无破损、大小均匀的绿豆种子分别按照表1进行处理。处理后的种子用无菌水冲洗3～4次，去除残留灭菌剂。

表1 不同灭菌处理方法分组

1.2.2 种子萌发

将灭菌处理后的种子接种到MS培养基中，每组3瓶，每瓶10粒。每天统计不同处理下绿豆的萌发情况(以下胚轴露出种皮1/2种子大小记为萌发)及污染情况。对生长7 d后不同处理下绿豆植株的主根长、茎长、生物量及异常株数进行统计。

1.2.3 外植体制备

将不同处理的绿豆种子种于MS培养基中，加少量无菌水促进萌发。2 d后，将绿豆的种皮剥下，用刀片切除部分下胚轴(约留子叶节以下1 mm)，沿种脐纵切豆子，将胚和子叶一分为二，使用去掉真叶和叶芽后的部分作为外植体，接种至分化培养基，每组3皿、每皿15个外植体。从3 d开始每隔2 d对不同处理后外植体的污染率进行统计，并及时将未污染的外植体转接至新的分化培养基中，用于统计外植体的污染情况，同时在第2周统计丛生芽分化率。

1.3 数据统计与分析

接种后定期观察，统计萌发率、污染率及丛生芽分化率：

萌发率=萌发种子数/接种种子数×100%；污染率=污染种子数/接种种子数×100%；丛生芽分化率=丛生芽数/接种种子数×100%。

采用Excel 2019和IBM SPSS Statistics 20软件进行数据统计分析和作图。

1.4 培养基及灭菌剂的配制

MS培养基，调pH至5.8，分装至组培瓶作为萌发培养基。3.16 g·L-1B5，0.59 g·L-1MES 缓冲液，30 g·L-1蔗糖配制分化培养基，调pH至5.7，高压蒸汽式灭菌121 ℃ 20 min，灭菌后加1 mg·L-16-苄基腺嘌呤，100 mg·L-1特美汀，100 mg·L-1头孢噻肟钠，6 m·L-1草铵膦。

次氯酸钠用30%浓度，过碳酸钠用4%浓度。氯气灭菌方法：将100 mL次氯酸钠倒进250 mL的锥形瓶中，并将装有绿豆的平皿放入干燥器中，在干燥器盖沿磨砂处涂抹凡士林，将盖子边沿留有缝隙；使用量筒量取20 mL浓HCl滴定到次氯酸钠溶液中，留一点浓盐酸液封，立即密封好干燥器，灭菌3、6 h；带好手套、口罩，待灭菌完成后，将装有灭菌绿豆的平皿放置在无菌超净台上吹除剩余的氯气(30 min)，密封好灭菌好的豆子，放置备用。

1.5 处理设计

设置不同灭菌剂及时间共8组，处理后用无菌水洗3遍，接种于MS培养基，用于萌发长势及污染率对比。另接种30粒左右于MS培养基并加少量无菌水促进萌发，2 d后，制备外植体接种到分化培养基，观察外植体的污染及分化情况。

2 结果与分析

2.1 灭菌方法对绿豆种子灭菌效果的比较

在所有设置的8种处理组中，只有过碳酸钠处理的2组在绿豆萌发3 d时出现污染，至7 d污染率分别达到了83%和67%(表2)。这一结果表明，4%的过碳酸钠不适合用作绿豆灭菌剂。除此之外，只有T3处理组的1个重复中出现了污染，其他均无污染。

2.2 不同灭菌处理对绿豆种子萌发的影响

在处理4 d时，除氯气处理的2组(T7和T8)各有2粒未萌发外，其余6组处理均全部萌发，且这2组至7 d仍未萌发(图1、表3)。在接种1 d时，T8处理组未萌发，而T7萌发了3%。这一结果表明，氯气对绿豆种子伤害较大，影响其萌发，且处理时间越长，对萌发的影响越大。接种1 d时，T1、T3分别比T2、T4发芽率高且T1比T3以及T2比T4萌发率也较高，结果表明，次氯酸钠、乙醇处理时间的延长，均会导致绿豆萌发的延迟。同时在接种1 d时，T5处理组的萌发率比T6高，结果表明，过碳酸钠溶液处理时间的延长也会对绿豆的萌发产生影响。综上所述，不同处理方法对绿豆萌发的影响不同，且同一种灭菌剂随着处理时间的延长都会导致绿豆萌发的延迟。

表2 不同灭菌方法下绿豆种子的污染率 单位：%

图1 绿豆种子萌发

表3 不同灭菌处理绿豆种子的萌发率单位：%

2.3 不同灭菌处理对绿豆幼苗生长的影响

T2、T4处理组中绿豆幼苗的主根长及茎长比T1、T3处理下长且生物量也不低于后者，表明在乙醇处理时间相同的条件下，次氯酸钠灭菌时间的延长不会影响绿豆幼苗的生长(表4)。T3处理组的主根长小于T1处理，然而T4处理组的主根长及茎长大于T2处理，且这4种处理条件下绿豆幼苗生物量之间无显著差异。此外，过碳酸钠处理组15 min比30 min长势好，氯气处理组2个时间点无显著差异。这一结果表明，过碳酸钠处理时间的延长会影响绿豆幼苗的生长，而氯气处理时间的长短对绿豆幼苗影响较小。

表4 不同灭菌处理对绿豆幼苗生长的影响

在绿豆萌发过程中，几乎所有处理组中都出现一部分种子萌发后下胚轴生长至2～3 cm后停止发育的现象(图2、图3)。次氯酸钠处理30 min的T2、T4组较同等乙醇处理时间的T1、T3组异常株更多，同时T1比T3处理组且T2比T4处理组的异常株数少，说明随着乙醇和次氯酸钠处理时间的延长，均会对绿豆的正常生长产生影响。因此，为了保证绿豆植株的正常生长，在控制污染率的基础上，应尽量缩短灭菌时间以降低灭菌处理对绿豆生长发育的影响。氯气处理的T7、T8组也出现了33%和20%的异常株，过碳酸钠处理的T5、T6组存在60%以上的污染及发育异常，因此，不是绿豆种子有效的灭菌剂。

柱上无相同小写字母表示处理间差异显著(P<0.05)。图4 同。图2 绿豆萌发过程中异常株比率

图3 绿豆种子萌发异常株

2.4 不同灭菌处理对绿豆外植体的灭菌效果比较

T5、T6、T7组污染较严重，都在80%以上(表5)。其中T6组污染情况最严重，在11 d时已经全部污染。这一结果表明，过碳酸钠和氯气对绿豆种子灭菌效果较差。T2组最终污染率为4%，是8组中污染率最低的。

表5 不同灭菌处理绿豆外植体的污染率 单位：%

2.5 不同灭菌处理对绿豆外植体丛生芽分化的影响

T6处理组在统计之前就已全部污染，所以未统计其丛生芽分化率。T1～T4处理组丛生芽分化率达到60%以上，其中，T2组最高，分化率达到了82%(图4～5)。T5、T7污染严重且分化率低，T8分化率为80%，但污染率较高且存在未完全萌发的状况。因此，使用75%乙醇和30%次氯酸钠组合对绿豆种子进行灭菌处理能够在控制污染条件下保证丛生芽的分化率。T2组最终污染率为4%，在8组中污染率最低(表5)。因此，用75%乙醇30 s+30%次氯酸钠30 min对绿豆种子进行灭菌处理是最适合的绿豆种子灭菌方法。

图4 不同灭菌处理对绿豆外植体丛生芽分化率的影响

图5 绿豆外植体丛生芽分化

3 小结与讨论

在植物组织培养中，对灭菌剂的效果评价指标最主要的是萌发、污染及外植体分化3个方面，本研究分为萌发试验及外植体分化试验两大部分。从萌发试验来看，2组用过碳酸钠做灭菌剂的幼苗污染严重，氯气灭菌会造成种子延迟萌发或不萌发。从外植体试验来看，过碳酸钠仍会造成大量的污染，氯气处理组也出现了污染，处理3 h比6 h污染率高，且处理6 h污染率也高达38%，若要继续延长灭菌时间，必定会引起萌发率降低及发育异常等情况。因此，本研究认为过碳酸钠及氯气均不适合作为绿豆种子的灭菌剂。

乙醇加次氯酸钠灭菌法是常用的联合灭菌法[9]，75%乙醇+30%次氯酸钠的灭菌方式在本研究中各项指标均较好，单从萌发试验来看，T2、T3的萌发速度较T1、T4高，T4存在较多异常株，可能是灭菌时间过长导致。外植体分化试验中T2、T3组在外植体污染率方面较为突出，T3组在萌发试验中存在27%的异常株，应为乙醇灭菌时间过长导致，综上所述，T2组75%乙醇30 s+30%次氯酸钠30 min是较好的绿豆种子灭菌方式。

组织培养成功的重要因素是降低污染率，对外植体材料的灭菌是关键前提，灭菌时间短会造成污染量大，灭菌不彻底的状况，灭菌时间过长则会导致萌发延迟、发育异常、分化率低等情况。氯化汞虽灭菌效果好，但毒性也大，会对种子造成伤害影响其生长[17]。4%过碳酸钠水溶液在烟草种子中灭菌效果良好[13]，但本研究发现，在绿豆种子的灭菌中灭菌效果极差，污染率很高。本研究发现，75%乙醇30 s+30%次氯酸钠30 min是较为安全有效的绿豆种子灭菌方式。