杨梅种子萌发的生理和基因表达变化*

曹 靖 戚行江 郑锡良 俞浙萍 张淑文任海英,3

(1.浙江省农业科学院园艺研究所 杭州 310021； 2.西北农林科技大学园艺学院 杨凌 712100； 3.湘湖实验室 杭州 311231)

杨梅(Myricarubra)是我国南方重要的特色果树，全国栽培面积约33.4万hm2，年产量约95万t，是山区农民增收致富的重要树种，其提取物含有抗氧化剂，可对抗炎症、过敏、糖尿病等健康问题(Sunetal.， 2013)。目前，杨梅产业上存在一些问题，比如树体高大，成熟期集中；成熟期遭遇梅雨季节，丰产不丰收现象严重；主栽品种‘东魁’受凋萎病危害严重等。因此，亟需培育树体长势中庸、成熟期长、抗病性好、优质有特色的杨梅品种。现有品种均为自然芽变、人工驯化的，人工远缘杂交是创新种质材料的重要手段。笔者前期研究发现，人工授粉后获得的杨梅种子发芽率仅有20%～30%，远低于自然野生杨梅的种子萌发率，而且从播种到发芽需要6～7个月，严重延滞了杨梅人工授粉杂交育种的考种进程。前人研究表明，杨梅种子经浓硫酸、赤霉素等处理后能促进萌发(倪海枝等， 2015)，但是萌发率仍然不高，萌发时间长且重复率较低。因此，明确杨梅种子萌发过程的生理生化和分子机制有助于研发催芽技术。

在种子萌发的过程中，淀粉、蛋白质、脂肪等营养物质发生转化，种子发芽时贮藏物质通过相关酶的作用分解提供营养和能量。淀粉酶主要由α-淀粉酶和β-淀粉酶组成，催化种子内淀粉的降解(Zhangetal.， 2005)。种子萌发的过程中，POD、SOD、CAT、APX酶活力会逐渐增加，清除细胞内的活性氧，维持正常的代谢活动，在一定范围内可以有效的解除休眠，随着种子萌发过程的结束酶活性下降(翟静娟， 2014； 田岐震等， 2021)。酚类物质是种子发芽的抑制剂，可以将H2O2转化成活性氧，高浓度抑制种子萌发(穆竟等，2019)。植物内源激素在种子的形成过程中起着重要的生理作用，ABA、GA、IAA、ZR是调控种子休眠与萌发的4种主要激素(Yanetal.， 2017)。ABA的合成在种子发育过程中能够抑制种子的萌发(Ali-Rachedietal.， 2004)。GA是ABA的拮抗因子，因而种子的休眠或萌发取决于这2种激素的平衡(张欣伟等， 2021)，随着种子的萌发ABA含量降低，GA的含量升高(Hoangetal.， 2014)。结缕草(Zoysiajaponica)种子NCED和CYP7070A(迟晓雪等， 2012)、拟南芥(Arabidopsisthaliana)的WRKY6、MAP3Ks(Choietal.， 2017)、TUA2(刘海浩等， 2012)、甘草(Glycyrrhizauralensis)种子GubAS(张豆豆等， 2016)等基因在种子的萌发过程中表达量降低。WRKY(Johnsonetal.， 2002)，MAP3K14、15、18(Choietal.， 2017)，HD2A、HD2B、HD2C、HD2D(Colvilleetal.， 2011)，PHYA(Footittetal.， 2017)，RVE2等基因与ABA有关，能抑制种子萌发。TUA2(Pengetal.， 2012)和MdCIbHLH1(任怡然等， 2015)等能促进GA合成，从而调节种子的萌发。

因此，针对杨梅种子萌发率低和萌发需要时间长的问题，本文对种子萌发时抗氧化酶和淀粉酶活性、激素、总酚类物质、基因表达等的动态变化进行研究，阐明影响杨梅种子萌发的因素，为研发促进杨梅种子高效催芽的技术、创制杨梅新种质提供理论和技术基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

从沙藏催芽的苗圃地里采集刚播种的杨梅种子以及幼根长分别为0～1cm、1～2cm、2～3cm和3cm以上4个萌发阶段的杨梅种子。将上述试验材料放入液氮中速冻，然后储存在超低温冰箱中备用。成熟的杨梅种子由木质化的内果皮、种皮和种仁组成。

1.2 试验方法

1.2.1 酶活力测定 使用愈创木酚法测定过氧化物酶(POD)活力(上海优选生物科技有限公司试剂盒)； 高锰酸钾滴定法测定过氧化氢酶(CAT)活力(上海优选生物科技有限公司试剂盒)； 氮蓝四唑(NBT)法测量超氧化物歧化酶(SOD)活力(Giannopolitisetal.， 1977)； 紫外分光法测定抗坏血酸过氧化物酶(APX)活力(孙云等， 2008)； 淀粉酶活性利用3,5-二硝基水杨酸测定(崔喜燕， 2008)，标准曲线方程为y=0.368 2x～0.004 9，R2=0.998 7。

1.2.2 激素含量测定 脱落酸(ABA)、赤霉素(GA3)、吲哚乙酸(IAA)、玉米素(ZR)等激素以ELISA法测定(Wangetal.， 2012)。

1.2.3 总酚含量测定 总酚含量的测定采用Folin-Ciocalteu法(孙勃等， 2010)，以不同浓度的没食子酸标样做标准曲线，以溶液中的没食子酸含量做横坐标，吸光度值做纵坐标。标准曲线为y=0.006 8x-0.0352，R2=0.9966。

1.2.4 基因表达量测定 利用TaKaRa公司的MiniBEST Plant RNA Extraction Kit(Code No. 9769)、PrimeScriptTMRT reagent Kit (Perfect Real Time)(Code No. RR037Q)、SYBR®Premix DimerEraserTM(Perfect Real Time) (Code No. RR091A)试剂盒提取杨梅种子的RNA、反转录试验、荧光定量(反应条件： 预变性95 ℃ 30 s；MrUBQ1做内参基因。反应条件如下： 3步试验(40个循环，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s)； 溶解(95 ℃1 s，65 ℃ 15 s，95 ℃ 1 s)； 冷却 37 ℃ 30 s。

△Ct (处理样品)=△Ctt(处理样品，目的基因)-△Ctr(处理样品，内参基因)，△Ct′ (对照样品)=△Ct′t(对照样品，目的基因)-△Ct′r(对照样品，内参基因)，△△Ct=△Ct (处理样品)-△Ct′(对照样品)。计算公式=2-Δ△Ct。引物及产物大小详见表1。

表1 相关基因实时定量qRT-PCR的特异性引物①Tab.1 Specific primers of related genes used for qRT-PCR

1.3 数据处理

采用Excel 2010和SPSS17.0软件对数据进行处理和显著性分析(P<0.05)。

2 结果与分析

2.1 酶活力动态变化

随着杨梅种子的萌发，主要抗氧化酶和淀粉酶活性均发生了显著变化(图1)。种子刚播种到种子幼根长为0～1cm时，POD、SOD、APX、α-淀粉酶等酶活力持续增高，萌发生长至0～1cm时，酶活力达峰值分别为227.22 U·g-1min-1、261.40 U·g-1、5.46 U·g-1、0.29 mg·g-1，种子幼根长1～2cm至幼根长大于3cm的生长过程中，酶活力持续降低(图1A、C、D、E)。种子萌发生长的过程中，CAT酶活力为1.70～1.98 g-1·min-1，保持平稳增高(图1B)。β-淀粉酶在种子萌发过程中，幼根长0～1cm酶活力达峰值为1.09 mg·g-1，然后至幼根伸长至1～2cm时酶活力持续下降达到酶活谷底为0.42 mg·g-1，幼根长为2～3cm时增高，最后在幼根大于3cm时下降(图1F)。POD每个萌发阶段差异均达到显著水平(P<0.05)。以上结果表明，主要抗氧化酶和淀粉酶均参与了杨梅种子萌发过程的调控。

图1 杨梅种子萌发过程中酶活力变化Fig.1 The rules of enzyme activities during bayberry germination横坐标的1、2、3、4、5分别代表杨梅种子萌发过程的5个阶段，分别表示刚播种的杨梅种子和幼根长0～1cm、1～2cm、2～3cm和长于3cm。误差线上不同字母表示处理间差异显著(P<0.05)。1, 2, 3, 4, 5 of the abscissa represent the five stages of the seed germination process of Myrica rubra, indicating that the newly sown seeds and young roots are 0～1cm, 1～2cm, 2～3cm and longer than 3cm, respectively. Different letters on the error line indicate significant differences between treatments (P < 0.05).

2.2 激素动态变化

在杨梅种子萌发过程中ABA、IAA和ZR等3种激素含量均发生了显著变化(图2)。随着杨梅种子的萌发，IAA、ZR含量动态变化规律基本一致，为先增高后降低的趋势。ABA含量整体呈降低趋势，GA3含量没有显著变化。刚播种的杨梅种子IAA含量为28.75 ng·g-1，幼根长为2～3cm时达到峰值为48.62 ng·g-1，随后降低。ZR含量一直维持在较低的水平，幼根生长至0～1cm时ZR含量达到峰值为10.42 ng·g-1，然后降低，但是当幼根生长至2～3cm以及3cm以上时ZR含量又增加至与峰值接近。种子刚播种时，ABA含量最高为62.70 ng·g-1。在种子萌发过程中基本保持降低的趋势，ABA含量最低为30.31 ng·g-1。种子萌发的过程中，GA3含量为3.63 ～ 4.48 ng·g-1FW，整个萌发过程没有显著变化。以上结果表明，ABA含量降低以及IAA和ZR含量升高促进杨梅种子萌发。

图2 杨梅种子萌发过程中内源激素含量变化Fig.2 The rules of endogenous hormone content during the germination of bayberry seeds误差线上不同字母表示不同萌发阶段杨梅种子的同一种物质含量差异显著(P<0.05)。Different letters on the error line indicate that the content of the same substance in Myrica rubra seeds at different germination stages is significantly different (P < 0.05).

2.3 总酚含量动态变化

随着杨梅种子的萌发，总酚含量呈先增加后降低的趋势(图3)。刚播种的杨梅种子，总酚含量为347.58 mg·100 g-1。随着种子的萌发生长幼根长0～1cm时总酚含量达到峰值为363.66 mg·100 g-1。种子幼根开始生长时，总酚含量逐渐降低，种子幼根长于3cm时，总酚的含量降低至304.20 mg·100 g-1。以上结果表明，酚类物质很可能参与了杨梅种子萌发过程的调控。

图3 杨梅种子萌发过程中总酚含量变化Fig.3 The rules of total phenol content during the germination of bayberry seeds

2.4 基因表达量动态变化

所有检测的9个基因随着杨梅种子的萌发表达量均发生了显著变化。与未萌发阶段对照相比，萌发过程中表达量增高的基因是MAPKKK15，表达量阶段性有升高的基因是TUA2，MAPKKK15表达含量较对照提高397.0%～1313.03%，表达高峰期在幼根长2～3cm。TUA2表达含量较对照提高了25.63%～2191.91%，表达高峰期在幼根长2～3cm。这说明，MAPKKK15和TUA2可能正向调控杨梅种子的萌发。

图4 种子萌发过程中基因相对表达量Fig.4 Relative expression of genes during seed germination

与未萌发阶段对照相比，萌发过程中表达量降低的基因有YMCIbHLH1、PHYA、MAPKKK18、MAPKKK14、YMSQS1、FOA1、WRKY6，基因表达量降低范围分别为51.12%～78.47%、65.70%～92.28%、 20.77%～89.58%、24.56%～92.49%、34.70%～86.42%、17.38%～90.03%、30.60%～86.39%。这说明，YMCIbHLH1、PHYA、MAPKKK18、MAPKKK14、YMSQS1、FOA1、WRKY6等7个基因可能负向调控杨梅种子的萌发。

与未萌发阶段对照相比，萌发过程表达量有升高有降低的基因有HD2B、RVE1和YMBZIP等3个基因。基因表达量变化范围是-27.18%～121.52%、-83.40%～47.68%、-84.95%～20.27%。这说明，HD2B、RVE1、和YMBZIP等3个基因在杨梅种子萌发调控过程中的功能可能较复杂。

3 讨论

3.1 抗氧化酶和淀粉酶对种子萌发的作用

POD、SOD、CAT、APX等酶在种子萌发过程中酶活力增加，能够清除细胞中的活性氧，将H2O2控制在一定范围内，增强磷酸戊糖途径，解除种子的休眠，促进种子的萌发(黄智等， 2010； 谭萍等， 2020)。种子萌发过程中淀粉酶是重要的水解酶，而α-淀粉酶和β-淀粉酶是淀粉水解酶中2种最主要的酶(Smithetal.， 2005)。α-淀粉酶在种子萌发时形成，在有活力的种子萌发时起重要作用。在种子萌发初期，β-淀粉酶的酶活力较低，随着种子的萌发，酶活力逐渐增加，分解淀粉水解的产物麦芽糖。随着杨梅种子的萌发，POD、SOD、APX、α-淀粉酶等酶活力先增高后降低，CAT酶活力保持平稳增高，β-淀粉酶活力先增高后降低，随后增加，最后降低。本研究与翅果油树(Elaeagnusmollis)种子(翟静娟， 2014)、杜梨(Pyrusbetulaefolia)种子(李军霞等， 2011)等酶活力变化一致。利用PEG、赤霉素、ABA等处理种子增强种子中POD、SOD、CAT等酶的活力(吴道藩等， 2022)，也可利用赤霉素溶液、硫酸铜溶液和水杨酸溶液处理种子提高淀粉酶活性促进萌发(黄丹等， 2014； 张欣伟等， 2021)。本研究中的α-淀粉酶在种子萌发生长的过程中酶活力先增加后减少，β-淀粉酶的酶活力高于α-淀粉酶的酶活力。这与水稻(Oryzasativa)种子(冉景盛等， 2008)和大麦(Hordeumvulgare)种子(Georg-Kraemeretal.， 2011)的淀粉酶活力变化一致。

3.2 激素对种子萌发的作用

ABA、IAA、GA、ZR 4种激素对种子发芽至关重要。低浓度的ABA能够促进甜瓜(Cucumismelo)等种子的萌发(苗永美等， 2013)。CTK有助于细胞的分裂、伸长及胚胎发育所需养分的吸收，消除萌发抑制物，是促进种子萌发的激素之一，植物中的CTK大多为ZR(樊卫国等， 2004)。种子萌发过程中IAA合成有利于植物细胞壁的形成，一定浓度的IAA能够促进细胞的分裂，高浓度的IAA抑制种子萌发(陈丽培等， 2012)，山核桃(Caryacathayensis)种子经IAA浸泡处理，发芽率升高(李小飞等， 2016)。本研究中，杨梅种子萌发的过程中，内源ABA的含量逐渐减少，ZR含量增加，内源激素IAA含量先增加后降低，这与前人的研究结果基本一致，后续研究可设计处理杨梅种子的不同浓度梯度的ABA、ZR或者IAA溶液，筛选出最佳促进杨梅种子发芽的浓度。

ABA和GA 2种激素在种子萌发中具有重要的拮抗作用，GA促进种子发育，消除ABA的作用，调节ABA/GA是种子萌发的关键。已在棉花(Gossypiumhirsutum)籽粒中证实种子萌发期间变化明显，ABA持续下降后，GA开始作用(Wangetal.， 2019)，种子的萌发过程中GA3的含量高于ABA。然而本研究中的GA3在萌发的过程中持续保持较低的水平，这可能是杨梅种子萌发的过程中GA可能发挥较小的作用，有待进一步的研究。笔者已经做了不同浓度GA3溶液浸泡杨梅种子测定发芽率，10个月后没有任何种子萌发，这说明GA3对杨梅种子的萌发作用较小。

3.3 总酚对种子萌发的作用

在种子萌发过程中，由于酶活力的增加，加速酶解反应，产生大量的酚类物质，诱导POD、SOD等抗氧化酶活力的变化(谭萍等， 2020)。ABA能调节酚类物质的含量及浓度抑制种子的萌发，酚类调节IAA的合成调控种子的萌发和休眠，GA能消除ABA的抑制作用从而降低酚类物质的浓度，可以调节ABA和GA的浓度调控种子的萌发和休眠(魏海蓉， 2005)。低浓度的酚类物质处理种子，能促进百合(Liliumbrowniivar.viridulum)等种子的萌发； 高浓度的酚类物质处理则抑制种子的萌发。本研究中随着杨梅种子的萌发，总酚含量呈先增加后降低的趋势，这与ABA浓度降低和IAA浓度升高密切相关，这说明杨梅种子萌发过程中酚类物质和激素也存在着密切互作。因此，可以通过处理改变酚类物质的含量，调节种子的休眠与萌发。

3.4 基因调控对种子萌发的作用

有多种基因参与调控种子萌发过程。MAPKKK15和TUA2能够负调控ABA的表达(刘海浩等， 2012)，本研究中有相似表现，随着种子的萌发，ABA含量降低，而MAPKKK15和TUA2的基因表达量增加。PHYA能影响激素信号和ABA/GA的动态平衡并调节种子休眠，ABA/GA信号传导途径的平衡有利于ABA增强对休眠诱导时间信号的反应，PHYA有助于加速诱导休眠，是种子ABA调控的关键(Footittetal.， 2017)。FOA1的表达与ABI5相似，ABI5是调节ABA信号的关键。ABA反馈调节FOA2，从而调节GA或ABA合成，进而调节种子的萌发。YMCIbHLH1、PHYA、MAPKKK18、MAPKKK14、YMSQS1、FOA1、WRKY6等7个基因随着杨梅种子的萌发表达量降低，这与Choi等(2017)的研究结果一致。HD2B是HD2家族的一员，对种子萌发及幼苗生长起着重要的调节作用，能够抑制种子的萌发(Colvilleetal.， 2011)。目前报道较多的是ABA和GA的基因通路，IAA、ZR等激素通路研究较少。因此，研究种子萌发过程中的调控基因的变化规律，为进一步明确杨梅种子萌发的影响因子提供理论依据。

4 结论

主要抗氧化酶和淀粉酶参与了杨梅种子萌发过程的调控，ABA含量降低以及IAA和ZR含量升高促进杨梅种子萌发，GA和总酚含量变化不显著。与ABA信号通路相关的MAPKKK15、TUA2、PHYA、MAPKKK18、YMSQS1、WRKY6、HD2B、MAPKKK148个基因以及与GA信号通路相关的FOA1、RVE1、YMCIbHLH1、YMbzip4个基因在种子萌发过程中表达量均有变化。综上所述，抗氧化酶、淀粉酶、IAA、ZR、ABA主要参与了杨梅种子萌发过程的调控，ABA信号通路和GA信号通路的部分关键基因表达量发生了变化。