银腺杨84K盐胁迫应答基因PagMYBR96的克隆及表达分析*

赵 凯 樊 艳 邹圣强 郇旭辉 杜淑辉 韩有志 王升级

(山西农业大学林学院 太谷 030801)

植物由于自身生长的固着性，在自然环境中非常容易遭受到逆境胁迫的影响。随着全球气候环境的不断恶化，逆境胁迫对植物生长发育造成的影响越来越严重(Lobelletal., 2011)。在长期适应的过程中，植物已经进化出了一系列分子机制来应对这些逆境胁迫，涉及到许多复杂的基因调控网络(Luetal., 2018)。转录因子基因因其强大的调控功能，在植物应对生物及非生物胁迫方面发挥了重要的作用，植物中过量或抑制表达一些胁迫应答转录因子基因会对其抗逆能力产生显著影响。

MYB转录因子家族是植物中最大的转录因子家族之一，随着1982年在禽成髓细胞瘤病毒中发现首个MYB家族基因v-myb(Klempnaueretal., 1982)，以及1987年从玉米(Zeamays)中鉴定出首个植物MYB基因ZmMYBC1(Paz-Aresetal., 1987)，越来越多的MYB家族基因被挖掘。MYB转录因子包含高度保守的由1～4个不完全相同的R序列重复组成的MYB结构域(Dubosetal., 2010)。每一个R序列由约52个氨基酸构成，形成3个α螺旋，其中规则间隔的色氨酸残基可与第2和第3螺旋形成螺旋-转角-螺旋(HTH)结构疏水核心(Dubosetal., 2010; Kanei-Ishiietal., 1990)。在以往的研究中，根据MYB结构域中R序列重复的数量，将该家族成员分为MYB-related、R2R3-MYB、3R-MYB和4R-MYB 4个亚家族。

MYB转录因子参与调控多种重要的生物学过程。植物中4R-MYB蛋白的数量很少，到目前为止很少有人关注，其中拟南芥(Arabidopsisthaliana)4R-MYB蛋白AtSNAPc4在配子体和受精卵发育过程中发挥重要作用(Thiedigetal., 2020)。植物3R-MYB亚家族同样具有较少的成员，参与调控植物生长发育及非生物胁迫应答等过程(Fengetal., 2017)。水稻(Oryzasativa)OsMYB3R-2不仅参与调节细胞周期过程，还可以正向调控植物的耐寒性(Maetal., 2009)。在拟南芥中过表达TaMYB3R1会导致植物在生殖阶段发育迟缓，但对干旱和盐胁迫的耐受能力增强(Caietal., 2015)。玉米3R-MYB转录因子基因ZmMYB3R可被干旱、盐、脱落酸处理诱导表达，过表达该基因可以增强植物对干旱和盐胁迫的耐受能力(Wuetal., 2019)。R2R3-MYB亚家族是MYB家族中成员最多、研究最为广泛的亚家族，有研究表明全基因组复制事件和基因片段重复事件是导致该亚家族扩张的主要原因(Duetal., 2015)。许多R2R3-MYB蛋白都可以与MYB-core和AC-rich元件结合，在植物生长发育及胁迫应答等诸多方面发挥重要作用(Millardetal., 2019)。R2R3-MYB蛋白AtMYB12和AtMYB111可以调控拟南芥根和叶中类黄酮的生物合成(Strackeetal., 2007)。杨树(Populusspp.)PtoMYB216可以激活木质素生物合成过程，参与调控其木材形成(Tianetal., 2013)。白桦BplMYB46可以调控植物次生壁生物合成及对盐和渗透胁迫的耐受性(Guoetal., 2017)。MYB-related蛋白属于MYB家族的第2大亚家族，随着首个植物MYB-related蛋白马铃薯(Solanumtuberosum)MybSt1被鉴定(Baranowskijetal., 1994)，不同物种中的该亚族蛋白也逐渐被分离出来。结构多样的MYB-related蛋白可以被分为CCA1-like/R-R、CPC-like、TBP-like、I-box-like、TRF-like和GARP 6个亚家族(Yangetal., 2021)，同样参与调控植物生长发育过程与胁迫应答。MYB-related蛋白CCA1 和 LHY可以协同调控拟南芥昼夜节律(Luetal., 2009)。过表达CCA1还会导致拟南芥的下胚轴变长，开花时间推迟(Luetal., 2012)。葡萄GARP 型转录因子VaAQUILO可以正向调控植物对寒冷的耐受性(Sunetal., 2018)。近年来围绕MYB-related蛋白开展了一些研究，也对杨树MYB-related转录因子家族及其基因表达模式进行系统的分析(Yangetal., 2021)，但杨树中关于该亚族成员的研究鲜有报道。

土壤盐碱化是全球性环境问题，且在我国的许多省区均有分布，总面积已经达到了9 900万公顷(廖婕等, 2021)。杨树生长快，适应性强，分布广阔，被广泛用于绿化、造林和制造业，是重要的经济用材树种。而土壤盐碱化极大地限制了杨树的生长发育及空间分布，而气候异常、工业污染、灌溉施肥方式不当等各类因素影响使这一情况越来越严峻(冷春旭等, 2020)。因此，鉴定出关键的杨树盐胁迫应答基因并解析其作用机制具有重要意义。本研究通过对转录组测序数据进行分析，发现一个银腺杨84K(Populusalba×P.glandulosa‘84K’)新的盐胁迫应答基因PagMYBR96，对该基因进行克隆，得到其蛋白序列，利用生物信息学分析揭示了其蛋白特征。通过亚细胞定位及转录激活活性分析发现该蛋白为核定位蛋白，但在酵母中没有自激活活性。基因时空表达模式分析结果表明，PagMYBR96在叶和根中具有相似的表达模式，均在盐胁迫前期上调表达随后恢复。通过对24份转录组测序数据进行分析，得到了518个PagMYBR96的共表达基因，利用基因功能注释及富集分析初步揭示了他们的分子功能及参与到的生物学过程，可为深入探究PagMYBR96基因功能及其调控机制，利用基因工程技术改善杨树抗逆能力提供理论支持和基因资源。

1 材料与方法

1.1 试验材料

植物材料为在温室中生长1个月的84K杨组培苗，培养条件如下： 光照/黑暗周期为16 h/8 h，平均温度为25 ℃，相对湿度为60%～70%。

1.2 基因克隆

通过在Phytozeme数据库中进行检索(Goodsteinetal., 2012)，得到PagMYBR96在毛果杨(Populustrichocarpa)中的同源基因PtrMYBR96(Potri.010G193000.1)的转录本序列，在5′ 和3′ UTR区设计基因扩增引物PagMYBR96-F和PagMYBR96-R(表1)。剪取84K杨组培苗叶片组织，速冻于液氮中后，使用TaKaRa MiniBEST Plant RNA Extraction Kit试剂盒提取样品RNA，然后使用PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser试剂盒将RNA反转录为cDNA。以该cDNA为模板，使用设计好的引物进行PCR扩增。得到目标片段后，将其与pMD19-T载体连接后送至生物公司进行测序。将测得的序列与PtrMYBR96转录本序列进行比对，确定PagMYBR96的编码区序列。

表1 本研究使用的引物Tab.1 Primer sequences used in this study

1.3 生物信息学分析

使用ProtParam工具对蛋白质的理化性质进行分析(Gasteigeretal., 2005)。在NCBI网站(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中的blastp对同源蛋白进行检索。使用BioEdit软件进行序列相似性比较及可视化分析(Hall, 1999)。使用SMS工具对构建系统发育树的最佳模型进行筛选(Lefortetal., 2017)。使用MEGA11、极大似然法、1 000次重复的bootstrap测试、SMS工具筛选出的最佳模型进行系统发育树的构建(Koichiroetal., 2021)。使用ProtScale工具进行蛋白亲疏水性分析(Gasteigeretal., 2005)。使用Tmpred工具对蛋白的跨膜区域进行预测(Hofmannetal., 1993)。使用在线软件SignalP 4.1 (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)对蛋白的信号肽进行预测。使用在线工具NetPhos 3.1 (http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/)对蛋白的磷酸化位点进行预测。使用在线工具SOPMA (https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html)对蛋白质的二级结构进行预测。使用在线软件ProtComp(http://linux1.softberry.com/berry.Phtml?topic=protcomppl&group=programs&subgroup=proloc)和WoLF PSORT(https://wolf psort.hgc.jp/)对蛋白的亚细胞定位情况进行预测。

1.4 亚细胞定位

为了对PagMYBR96的亚细胞定位情况进行分析，构建了GFP蛋白融合表达载体。首先，去掉PagMYBR96基因编码区序列的终止密码子，然后设计酶切引物(表1)，以PagMYBR96的T载质粒为模板进行PCR扩增，收回目标片段。使用XbaI和SalI对收回的基因片段和pBI121-GFP空载质粒进行双酶切。使用T4 DNA连接酶对酶切产物进行连接，将连接产物转入大肠杆菌(Escherichiacoli)后，对阳性克隆进行测序确认。提取构建成功的pBI121-PagMYBR96-GFP质粒，转入农杆菌(Agrobacterium)EHA105中，使用农杆菌介导的烟草(Nicotianatabacum)叶片瞬时转化试验进行亚细胞定位分析，具体步骤参考之前的研究(赵凯, 2021)。

1.5 转录激活活性分析

为探究PagMYBR96蛋白是否具有自激活活性，使用酵母(Saccharomyces)试验对其进行分析。首先，基于PagMYBR96的编码区序列设计同源融合引物(表1)。以PagMYBR96的T载质粒为模板进行PCR扩增，然后收回目标片段。使用BamH I对pGBKT7空载质粒进行酶切，利用同源重组试剂盒将目标片段整合到pGBKT7载体上。提取构建成功的pGBKT7-PagMYBR96载体质粒，将其转入到Y2Hgold酵母细胞中。在SD/-Trp和SD/-Trp/-His/-Ade/X-α-Gal固体培养基上对转入不同质粒的酵母细胞进行划线培养，通过观察细胞的生长情况来判断蛋白是否具有转录激活活性。转入pGBKT7空载质粒的Y2Hgold酵母细胞用作阴性对照，转入pGBKT7-53/pGADT7-T载体的Y2Hgold酵母细胞用作阳性对照。

1.6 基因表达模式分析

为了探究PagMYBR96基因对盐胁迫的应答情况，对该基因在盐胁迫条件下的时空表达模式进行分析。首先，将在组培瓶中生长1个月的84K杨野生型幼苗移栽到土盆中，在温室中继续培养1个月。将生长健壮的植株分为6组(每组8株)，使用150 mmol·L-1NaCl溶液分别胁迫处理3、6、12、24和48 h，水处理作为对照，设置3次生物学重复。处理结束后，同时收集植株的叶和根组织，提取RNA后反转录为cDNA，使用表1中设计好的定量引物进行RT-qPCR试验，Actin基因用作内参基因。以基因在对照样品中的表达水平为基准，用2-ΔΔCt法计算基因的相对表达水平。使用IBM SPSS Statistics 21.0 (http://www.ibm.com/us/en/)对数据进行统计分析(t检验，P<0.05)。

1.7 基因共表达分析

利用美吉生物云平台(www.majorbio.com)对基因表达相关性进行分析，挖掘与PagMYBR96具有相似表达模式的基因。基于实验室前期研究中测得的24个样品的转录组数据进行分析，包含盐胁迫处理的根、茎、叶、芽组织及对照样品。各个样品中的基因表达量(TPM值)之和≥10的基因被用于表达相关性分析，相关性算法为Spearman，相关性系数为0.8，多重检验校正方法为Benjamini-Hochberg，阈值为padj值≤0.05。

1.8 基因功能注释与富集分析

利用美吉生物云平台(www.majorbio.com)对上一步分析中获得的共表达基因集进行GO功能注释、GO富集分析和KEGG富集分析。

2 结果与分析

2.1 84K杨PagMYBR96基因克隆及其氨基酸理化性质分析

以84K杨的cDNA为模板进行PCR扩增，得到长度约为1 388 bp的DNA片段。随后，通过与PtrMYBR96的转录本序列进行比对，得到长度为882 bp的PagMYBR96编码区序列(GenBank登录号： ON862133)。通过对该基因编码的氨基酸序列进行分析，发现PagMYBR96蛋白由293个氨基酸组成，分子质量为33 306.33 Da，理论等电点为 6.32，分子式为 C1475H2283N413O453S8，总原子数为 4 632，脂肪系数为 67.54。该蛋白的不稳定系数(II)为43.10，总平均亲水性为-0.707，表明其为不稳定的亲水性蛋白质。

2.2 生物信息学分析

通过NCBI网站(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中的blastp对PagMYBR96蛋白的氨基酸序列进行检索，得到10个不同物种中与其同源性最高的蛋白。通过系统发育分析这些蛋白之间的进化关系。由图1可知，84K杨PagMYBR96与长梗柳(Salixdunnii)中的MYB蛋白的亲缘关系最近，与麻风树(Jatrophacurcas)、蓖麻(Ricinuscommunis)、木薯(Manihotesculenta)、橡胶树(Heveabrasiliensis)中的MYB蛋白的亲缘关系较近，而与杨梅(Morellarubra)、欧洲栓皮栎(Quercussuber)、克莱门柚(Citrusclementina)、哥伦比亚锦葵(Herraniaumbratica)、榴莲(Duriozibethinus)中的MYB蛋白的亲缘关系较远(图1A)。多序列比对的结果显示，这些蛋白均含有保守的MYB结构域和特征氨基酸(2个色氨酸和1个丙氨酸)(图1B)。此外，包括PagMYBR96在内的9个蛋白均含有保守的SHAQKYF基序，表明它们属于CCA1-like/R-R亚家族(图1B)。

图1 不同物种中MYB蛋白的系统发育分析及多序列比对Fig.1 Multiple sequence alignment and phylogenetic analysis of MYB proteins of different speciesA: PagMYBR96及其同源蛋白间的系统发育分析； B: PagMYBR96及其同源蛋白的氨基酸序列比对结果。A: Phylogenetic analysis of PagMYBR96 and its homologous proteins; B: Multiple sequence alignment results of the amino acid sequences of PagMYBR96 and its homologous proteins.

通过对PagMYBR96蛋白的亲疏水性进行分析发现，该蛋白可能是亲水性蛋白质，这与蛋白质理化性质分析的结果一致。跨膜区域分析结果显示，PagMYBR96蛋白没有跨膜区域。

信号肽一般位于蛋白的N端，也可分布于蛋白的其他位置，长度变化较大，由15～50个以上氨基酸构成，具有蛋白质定向转运的功能(彭佳师等, 2011)。信号肽预测结果表明，PagMYBR96蛋白中不存在信号肽。

蛋白质磷酸化主要发生在丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸上，是蛋白质翻译后修饰的主要方式，在调节植物生命过程方面发挥重要作用(赵晓亭等, 2021)。通过对PagMYBR96蛋白的磷酸化位点进行预测发现，该蛋白存在20个丝氨酸位点，11个苏氨酸位点，3个酪氨酸位点。

蛋白质二级结构预测的结果显示，PagMYBR96蛋白中参与形成无规则卷曲的氨基酸最多，为163个，占到氨基酸总数的55.63%； 参与形成β-转角的氨基酸数量最少，为8个(2.73%)； 此外，还有72个氨基酸(24.57%)参与形成α-螺旋，50个氨基酸(17.06%)参与形成延伸链。

2.3 PagMYBR96的亚细胞定位

在线软件ProtComp和WoLF PSORT的预测结果表明，与大多数转录因子一样，PagMYBR96也定位在细胞核中。为了对预测结果进行进一步验证，利用农杆菌介导的瞬时转化试验在烟草叶片中表达PagMYBR96-GFP融合蛋白，并在激光共聚焦显微镜下观察。如图2所示，对照35 S:GFP蛋白的荧光信号可以在整个细胞中观察到，而PagMYBR96-GFP融合蛋白的荧光信号只存在于细胞核中。以上试验结果表明，PagMYBR96是一个核定位蛋白，这与预测的结果一致。

图2 PagMYBR96蛋白的亚细胞定位Fig.2 Subcellular localization of PagMYBR96 proteinA, D: GFP荧光； B, E: 明场； C, F: GFP荧光和明场的组合图。A, D: GFP fluorescence; B, E: Bright field; C, F: Combination of GFP fluorescence and bright field.

2.4 PagMYBR96的转录激活活性分析

为了探究PagMYBR96蛋白是否具有转录激活活性，将PagMYBR96基因的编码区序列连入pGBKT7 载体，并将pGBKT7-PagMYBR96质粒、pGBKT7空载质粒(阴性对照)和pGBKT7-53/pGADT7-T质粒(阳性对照)分别转入Y2HGold酵母菌株。挑取转化成功的酵母细胞振荡培养，并分别接种到SD/-Trp和SD/-Trp/-His/-Ade/X-α-Gal 固体培养基上观察生长状态。由图3可知，含有pGBKT7-PagMYBR96质粒的酵母细胞与阴性对照一样只能在SD/-Trp固体培养基上生长，而不能在SD/-Trp/-His/-Ade/X-α-Gal 固体培养基上生长； 而阳性对照可以在两种培养基上生长，并在SD/-Trp/-His/-Ade/X-α-Gal 固体培养基上变蓝。以上结果表明，PagMYBR96蛋白在酵母中没有转录激活活性。

图3 PagMYBR96的转录激活活性分析Fig.3 Transcriptional activation activity analysis of PagMYBR96

2.5 PagMYBR96基因应答盐胁迫的时空表达模式分析

转录组数据分析表明PagMYBR96基因可以在84K杨叶片中应答盐胁迫，使用RT-qPCR对基因的表达水平进行分析，该基因应答盐胁迫的时空表达模式。试验结果表明，在盐胁迫条件下，PagMYBR96基因在84K杨的叶和根中整体呈现先升高后回调的表达模式，且均在盐胁迫处理12 h时达到最高的表达水平(图4)。此外，PagMYBR96基因在根中的上调表达程度大于叶片，在盐胁迫处理6 h和12 h时该基因分别上调表达了3.62和7.28倍，均高于盐胁迫处理后叶片中的最高表达水平(2.45倍)。

图4 PagMYBR96基因应答盐胁迫的时空表达模式分析Fig.4 Temporal and spatial expression pattern analysis of PagMYBR96 gene in response to salt stress使用150 mmol·L-1 NaCl溶液进行盐胁迫处理，以未胁迫处理的样品中基因的表达水平为基准计算其他样品中基因的相对表达水平，星号代表处理样品与对照样品间有显著差异(t检验，P <0.05)。150 mmol·L-1 NaCl solution was used for salt stress treatment. The relative expression levels of genes were calculated based on the expression levels of genes in untreated samples. The asterisk represents a significant difference between the treated sample and the control sample (t test, P <0.05).

2.6 基因共表达分析

共表达分析可以挖掘到一些具有相似表达模式的基因，这些基因的功能可能是紧密相关的，也可能参与到一些相同的信号通路或生理过程(Zhaoetal., 2021)。基于本课题组前期研究中的24个样品的转录组测序数据(樊艳等, 2021)，建立以PagMYBR96为中心的基因共表达网络。如图5A所示，共鉴定出518个与PagMYBR96共表达的基因，其中有29个为转录因子基因(表2)，这些基因可能与其介导的一些重要的生物学过程相关。

2.7 基因功能注释与富集分析

为了探究PagMYBR96及其共表达基因的分子功能及参与到的生物学过程，对这些基因进行GO注释分析。结果表明，PagMYBR96及其共表达基因与催化活性、转运活性、结构分子活性和转录调节活性等功能相关，主要参与到细胞过程、代谢过程、生物调节、对刺激应答和发育过程等(图5B)。基因富集分析的结果显示，PagMYBR96及其共表达基因显著富集到类泛素蛋白结合酶活性、类泛素蛋白转移酶活性、泛素蛋白转移酶活性、泛素结合酶活性等GO term中(图5C)。此外，这些基因还被显著富集到氨酰-tRNA生物合成、泛素介导的蛋白水解和丙酮酸代谢等通路中(图5D)。

图5 基因共表达及富集分析Fig.5 Gene co-expression and enrichment analysisA: 以PagMYBR96为中心的基因共表达网络； B: 共表达基因集的GO注释分析； C: 共表达基因集的GO富集分析； D: 共表达基因集的KEGG富集分析。A: Gene co-expression network centered on PagMYBR96; B: GO annotation analysis of co-expressed gene set; C: GO enrichment analysis of co-expressed gene set; D: KEGG enrichment analysis of co-expressed gene set.

3 讨论

植物MYB-related转录因子亚家族成员众多，广泛参与到昼夜节律、次生代谢及细胞和器官形态建成等生理过程(Yangetal., 2021)。随着对MYB家族和MYB-related亚家族进行深入分析，MYB-related蛋白的特征、基因表达模式及可能参与到的生物学过程也逐渐被揭示。但是相较于对R2R3-MYB蛋白在调节花青素、木质素和次生壁合成等方面的深入研究，关于MYB-related蛋白的功能分析及调控机制的研究是有限的。对毛果杨MYB-related基因家族进行综合分析将这些成员分为6组，并对其组织差异表达模式及胁迫应答情况进行了系统的分析，发现这些基因可能参与抗氧化防御系统和各种信号通路的调节(Yangetal., 2021)。但目前对杨树MYB-related蛋白的功能分析却鲜有报道。本研究通过对转录组测序数据进行分析，挖掘到一个应答盐胁迫的84K杨MYB-related基因PagMYBR96，随后将其克隆出来并进行了较为系统的生物信息学分析。亚细胞定位试验的结果表明，PagMYBR96蛋白同大多数转录因子一样，定位在细胞核中，可能在细胞核中发挥转录调控的功能。自激活活性分析试验表明PagMYBR96蛋白在酵母中没有转录激活活性，这一结果表明该蛋白可能需要在植物体内进行翻译后修饰来获得转录激活活性或与其他具有转录激活活性的蛋白相互作用从而起到转录激活作用。基因时空表达模式分析试验结果表明，PagMYBR96在84K杨的叶和根中均可以应答盐胁迫，且具有相似的表达模式。此外，盐胁迫条件下该基因在根中的上调表达程度高于叶片，这可能与根组织直接暴露于胁迫处理下有关。以上的研究结果均表明PagMYBR96可能在杨树盐胁迫应答方面发挥重要的作用，因此本研究对24份转录组测序数据进行挖掘，利用基因共表达分析将未知功能的基因与生物过程联系起来。

通过对26 583个基因在24个测序样品中的表达情况进行分析，共鉴定到518个与PagMYBR96共表达的基因。通过对这些基因进行注释，发现其中有29个转录因子基因，涉及21个转录因子家族，包括一些常见的AP2、bHLH、bZIP、MYB、NAC等家族成员。通过对这些基因进行检索发现它们参与到许多不同的生物学过程。PtrARF2.2下调表达会导致叶片表型轻微变化(Fuetal.， 2019)。Potri.015G105200是ICEs的直系同源基因，在冷胁迫条件下上调表达(杨艳梅, 2019)。PtrAREB1-4是拟南芥抗旱基因AtAREB1的同源基因，可以被干旱胁迫高度诱导表达(Lietal.， 2018)。PtrGATA34是杨树 GATA 亚家族 III 基因，在启动子序列中具有CGTCA 基序和 TGACG 基序，可能参与茉莉酸应答反应(Anetal., 2019)。小黑杨(Populussimonii×P.nigra)PsnHSF20在高温和盐胁迫处理条件下显著上调表达(王雪怡等, 2021)。杨树MYB-related蛋白LHY2在昼夜节律调节方面发挥重要作用，抑制该基因的表达会导致植物生物量降低(Edwardsetal.， 2018)。PtrNF-X1-4在杨树的韧皮部表达量较高(Heetal.， 2021)。PtrGRF1/2b在休眠芽和幼叶中高表达，且与GIF基因共表达(Zhangetal.， 2021)。Potri.011G096600是杨树叶片发育调控因子miR319a可能的靶基因(Chengetal., 2021)。通过对这些共表达的转录因子基因在拟南芥中的同源基因进行检索，发现一些在植物应对非生物胁迫过程中发挥重要功能的基因。如，在冷胁迫应答过程中发挥关键作用的基因AtICE1和AtMYC70； 可增强植物抗旱性的基因AtAREB1和AtHSFA1b。以上研究结果表明，PagMYBR96很可能在杨树生长发育及胁迫应答方面发挥重要作用。

为了进一步探究PagMYBR96与其共表达基因参与到的生物学过程，对这些基因进行GO注释分析。这些基因广泛参与到细胞过程、代谢过程、生物调节、对刺激应答和发育过程等重要的生物学过程中，表明这些基因具有重要的功能。GO富集分析的结果显示，这些基因被显著富集到类泛素蛋白结合酶活性、类泛素蛋白转移酶活性、泛素蛋白转移酶活性和泛素结合酶活性等GO term中。泛素蛋白酶体系统是细胞内蛋白质降解的主要途径，广泛存在于真核生物中，在植物生长发育和逆境胁迫应答方面起到关键作用。泛素结合酶(E2)是泛素蛋白酶体系统的重要组成部分，在植物应对非生物胁迫过程中发挥重要作用(张洪雨等, 2020)。值得注意的是，KEGG富集分析同样将这些基因富集到泛素介导的蛋白水解通路中。以上结果表明，PagMYBR96与其共表达基因在植物生长发育及逆境应答方面发挥重要作用，且与泛素蛋白酶体系统介导的蛋白质降解过程相关。此外，这些基因还被显著富集到氨酰-tRNA生物合成和丙酮酸代谢等通路中，其中丙酮酸作为糖酵解的终产物和线粒体呼吸的主要底物，在碳代谢调节过程中起到重要作用(Leetal., 2021)，这也是今后研究中应探索的方向。本研究为解析杨树MYB-related基因的功能及调控机制提供了基础，也为杨树抗逆分子育种提供了科学依据与基因资源。

4 结论

基于转录组测序数据分析，在银腺杨84K中鉴定到一个应答盐胁迫的MYB-related基因PagMYBR96，其编码区序列为882 bp，编码293个氨基酸，含有一个保守的MYB结构域和特征氨基酸。该基因在银腺杨84K的根和叶中均可应答盐胁迫，且呈现出胁迫前期上调表达随后渐渐恢复的表达模式，其编码蛋白为核定位蛋白且在酵母中没有转录激活活性。与PagMYBR96共表达的518个基因中包含29个与植物生长发育及胁迫应答密切相关的转录因子基因，且被显著富集到在植物中发挥重要作用的丙酮酸代谢及泛素蛋白酶体系统相关的GO term及通路中。