广西鸭坦布苏病毒流行株GXQZ01-DTMUV-2020全基因组序列分子特征分析

谢守玉，熊陈勇，施开创，李 军，郑 敏，韦显凯，冯淑萍，屈素洁，龙 凤，杨 蓉，陆文俊，骆永泉，钟华训，侯慧贤，覃婉婷，韦慧琦，尹彦文*

(1.广西动物疫病预防控制中心，广西 南宁 530001；2.广西大学 动物科学技术学院，广西 南宁 530005；3.贺州市水产畜牧站，广西 贺州 542699)

坦布苏病毒(Tembusu virus,TMUV)是属于黄病毒科黄病毒属恩塔亚病毒群不分节段的单股正链RNA病毒。1955年，首次从马来西亚的三带喙库蚊体内分离到TMUV。目前，已从鸭、鸡、鹅、麻雀及蚊子体内发现该病毒[1]。2010年，上海地区的麻鸭出现生长迟缓、高热、食欲减退、产蛋下降及死亡症状。随后，我国养鸭主产区的东南省份，如浙江、江苏、福建、山东、湖南等地相继有疫情发生，发病率高达90%，病死率为5%～30%，致病原曾被称为“鸭产蛋下降综合征病毒”，后经证实为鸭坦布苏病毒(duck Tembusu virus,DTMUV)[2-4]。马来西亚和泰国的蛋鸭养殖场陆续有DTMUV引发疫情的报道[5-6]。

DTMUV基因组全长约11 kb，包含5′端和3′端非编码区(UTR)，以及1个开放阅读框(ORF)。ORF编码C、prM和E 等3种结构蛋白，以及NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B和NS5等7种非结构蛋白。E蛋白是DTMUV主要膜蛋白和结构蛋白，为宿主的重要保护性抗原，能够诱导动物机体发生特异性免疫应答，产生中和抗体[7]。NS1蛋白是胞外分泌性蛋白和多效应蛋白，也是在病毒复制过程中产生的重要抗原，可诱导机体产生细胞免疫反应[8]。E蛋白和NS1蛋白均具有良好的免疫原性，是DTMUV亚单位疫苗研发的重点对象。为了解广西DTMUV流行毒株基因组分子特征，本试验利用已建立的DTMUV检测方法[9]，从诊断为DTMUV阳性的病料中扩增全基因组序列，与国内外参考毒株进行相似性比较，对ORF、E及NS1基因进行遗传进化分析，发现广西DTMUV流行毒株呈现遗传多样性的特征，以期为广西DTMUV流行情况调查提供数据支持，为DTMUV有效防控和致病机理研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 主要试剂核酸抽提试剂盒(批号：20120110T015)购于天隆科技公司；PrimeScriptTMOne Step RT-PCR Kit Ver.2(批号：ASF0454A)、MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver 4.0(批号：AK11054A)、pMD18-T载体(批号：AK91481A)、大肠杆菌DH5α感受态细胞(批号：AK71028A)均购于宝生物(大连)公司。

1.2 病料检测病料来自2020年广西钦州某养鸭场发病的麻鸭。采集患病麻鸭肝脏、脾脏、肾脏、肺脏等组织样品，剪成小块后放入2 mL灭菌离心管中，加入适量PBS，经磨碎仪研磨至糜状，离心后取上清提取核酸，作为模板，利用本实验室已建立的DTMUV检测方法进行检测[9]。

1.3 病毒全基因组扩增测序与比对以DTMUV检测结果为阳性的核酸为模板，利用本试验设计的DTMUV全基因组测序引物(表1)进行RT-PCR扩增。建立50 μL反应体系：模板2 μL，PrimeScript One Step Enzyme Mix 2 μL，2×One Step Buffer 25 μL，上、下游引物各1 μL(20 μmol/L)，无RNA酶灭菌水补足体系。反应程序：50℃ 30 min；94℃ 2 min；94℃ 30 s，50℃ 30 s，72℃ 2 min，35个循环。反应结束后，PCR产物通过1.0%琼脂糖凝胶电泳鉴定。

表1 全基因组测序引物

PCR产物胶回收纯化后，连接至pMD18-T载体，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，筛选阳性克隆测序，每个片段重复测序3次。使用DNAStar软件包中的SeqMan拼接测序获得的片段，最终得到GXQZ01-DTMUV-2020株全基因组序列，并将GXQZ01-DTMUV-2020株全基因组序列同参考毒株进行比对。

1.4 DTMUV全基因组序列分析应用BioEdit软件对GXQZ01-DTMUV-2020株及参考毒株(表2)全序列进行核苷酸和氨基酸相似性分析。应用MEGA7软件对比对后的ORF、E及NS1基因序列进行最佳核苷酸替换模型评估：ORF为GTR+G+I；E、NS1基因均为TN93+G。以最佳核苷酸替换模型为基础，采用最大似然法(maximum likelihood)绘制系统发育树，Bootstrap值设置为1 000次。应用RDP 4(recombination detection program 4)和SimPlot(ver 3.5.1)软件对GXQZ01-DTMUV-2020株及参考毒株的全基因组序列进行重组分析，检测是否有重组现象。应用BEAST(ver 1.10.4)软件包估算ORF、E及NS1基因的遗传进化速率，评估进化的快慢。

表2 DTMUV主要参考毒株信息

2 结果

2.1 全基因组测序与比对结果应用SeqMan程序拼接测序的片段，得到1株DTMUV，命名为GXQZ01-DTMUV-2020株。结果显示，GXQZ01-DTMUV-2020株全长为10 991 bp，5′端UTR为94 bp，3′端UTR为619 bp，含有1个开放阅读框(ORF)为10 278 bp，编码3 425个氨基酸。其中，3种结构蛋白基因C、prM和E长度分别为360，501，1 503 bp；7种非结构蛋白基因NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B及NS5长度分别为1 056，681，393，1 857，378，762，2 715 bp。MM_1775和GXQZ01-DTMUV-2020株的E、NS1蛋白氨基酸序列比对结果显示，E、NS1蛋白分别有14个和21个氨基酸位点发生变异(表3)。3′端UTR核苷酸序列比对发现，DTMUV-AH2011株在第82位至155位连续插入74个碱基。SD14株在第43位至49位，第71位至73位不连续插入共10个碱基。在第60个核苷酸位置，包括GXQZ01-DTMUV-2020株在内共有15株DTMUV插入1个G碱基。

表3 MM_1775和GXQZ01-DTMUV-2020株的E、NS1蛋白氨基酸序列对比

2.2 核苷酸与氨基酸相似性分析结果应用BioEdit软件对GXQZ01-DTMUV-2020株与参考毒株全序列相似性分析结果显示，其与广西DTMUV流行株的核苷酸相似性为94.1%～98.5%，氨基酸相似性为95.8%～100.0%；与水禽源TMUV参考毒株的核苷酸相似性为85.7%～99.7%，氨基酸相似性为92.0%～100.0%；与蚊虫源TMUV参考毒株的核苷酸相似性为85.8%～99.1%，氨基酸相似性为92.0%～100.0%。E、NS1基因与广西DTMUV流行株的核苷酸相似性为95.9%～96.4%和96.1%～97.6%，氨基酸相似性为99.0%～99.4%和98.2%～99.1%；与水禽源TMUV参考毒株的核苷酸相似性为89.3%～99.2%和87.4%～99.4%，氨基酸相似性为98.0%～99.8%和94.0%～100.0%；与蚊虫源TMUV参考毒株的核苷酸及氨基酸相似性为88.1%～98.0%和85.8%～99.0%，96.8%～99.4%和93.4%～99.7%；与鸡源TMUV(Sitiawan virus)核苷酸及氨基酸相似性为86.8%/96.8%，85.2%/92.6%(表4)。结果表明，GXQZ01-DTMUV-2020株与广西DTMUV毒株相似性较高，与水禽源TMUV相似性高于其他宿主源TMUV。

表4 GXQZ01-DTMUV-2020株与部分参考毒株同源性分析 %

2.3 遗传进化树绘制应用MEGA7对ORF、E及NS1基因绘制遗传进化树(图1，2)。ORF遗传进化树中(图1A)，MM_1775株与 Sitiawan virus组成TMUV群，SD14株为3群，DK/TH/CU-DTMUV2007株为1群。GXQZ01-DTMUV-2020株与广西GX2012，GX2013E株属于2.2亚群，广西GX2011，GX2015株与国内主要DTMUV毒株组成2.1亚群。结果表明，广西DTMUV流行毒株进化方向不完全相同，呈现遗传多样性特征。从图1A 中可以得出，GXQZ01-DTMUV-2020株与参考毒株CHN-YC和DTMUV/Goose/CHN/2019/AQ-19遗传关系距离较近，这与相似性分析结果一致。E基因(图1B)和NS1(图2)基因遗传进化树分布与ORF相似。

A.ORF;B.E基因。红色.2.2亚群；橙色.2.1亚群；紫色.1群；蓝色.3群；绿色.TMUV。下同

图2 DTMUV NS1基因遗传进化树

2.4 重组分析结果应用RDP4和SimPlot软件对GXQZ01-DTMUV-2020株与参考毒株的全基因组序列进行重组分析。结果显示，HB2016、HD2-2013、CHN-YC及AH2014株检测到重组信号(图3)。HB2016株重组的主要亲本为GA，相似性为98.9%，次要亲本为GX2015株，相似性为100%，重组位点为比对后的第2 049～4 054位；HD2-2013株重组的主要亲本为HD-2015株，相似性为99.3%，次要亲本为GDHD2014-3株，相似性为99.9%，重组位点为第5 675～7 237位；CHN-YC株重组的主要亲本为DTMUV/Goose/CHN/2019/AQ-19株，相似性为99.2%，次要亲本为MC株，相似性为100%，重组位点为第870～1 989位；AH2014株重组的主要亲本为HB2010株，相似性为99.9%，次要亲本为GX2015株，相似性为99.9%，重组位点为第2 044～4 002位。

A.HB2016;B.HD2-2013;C.CHN-YC;D.AH2014

2.5 遗传进化速率估算结果应用BEAST软件对GXQZ01-DTMUV-2020株及参考毒株的ORF、E及NS1基因遗传进化速率估算结果为1.146×10-3，1.467×10-3，1.319×10-3替换/(位点·年)，表明E基因进化速率最快。

3 讨论

广西壮族自治区地处沿海亚热带，与东南亚国家接壤，属于候鸟迁徙过冬地区，而TMUV宿主谱广泛，存在野鸟传播病毒的潜在风险。据报道，养鸭场从业人员的血清TMUV阳性检出率高达71.9%，说明TMUV宿主范围扩大，对公共卫生安全可能造成威胁[10]。因此，须加强对TMUV的流行情况调查及分子流行病学研究。本试验从广西钦州某蛋鸭养殖场采集病死鸭的脾脏、肝脏、肾脏、肺脏及卵巢组织，利用本实验室已建立的DTMUV病原诊断方法进行检测[9]，以阳性核酸为模板，进行DTMUV全基因组序列扩增，得到GXQZ01-DTMUV-2020全序列。通过序列比对发现，E蛋白氨基酸共有14个位点发生变异，其中第154～157位NYPV变异为NYSA。TMUV E蛋白第156位氨基酸的改变将影响病毒的组织嗜性和在动物群体间的传播能力，以及第154位氨基酸的糖基化修饰作用[11-13]。NS1蛋白有2个糖基化位点，通过借助E蛋白疏水信号进入内质网，在参与病毒侵袭、组装、释放及致病性方面都起到关键作用[14-15]。本研究中NS1有21个氨基酸位点发生变异，尚需深入探讨突变的意义。在3′端UTR区域，DTMUV-AH2011株连续插入74个碱基，SD14株不连续插入10个碱基，并且在系统发育树上为独立的分支(数据未列出)，尚未见其他文献有相关报道，至于突变对毒株的影响需要进一步研究。

相似性分析结果显示，GXQZ01-DTMUV-2020株基因组结构中，5′UTR、3′UTR、NS1、NS2A及NS4B与CHN-YC株核苷酸相似性最高；prM、E、NS2B、NS3及NS5与DTMUV/Goose/CHN/2019/AQ-19株核苷酸相似性最高。其中，C和NS4A基因核苷酸相似性与CHN-YC和DTMUV/Goose/CHN/2019/AQ-19株并列最高，为99.4%和98.9%，氨基酸相似性均为100%。以上结果表明，GXQZ01-DTMUV-2020基因组呈现分子遗传多样性特征。GXQZ01-DTMUV-2020与国内TMUV参考毒株的核苷酸相似性为85.7%～99.7%，氨基酸相似性为92.0%～100%。E、NS1基因与国内TMUV参考毒株的核苷酸相似性为89.3%～99.2%和87.4%～99.4%，氨基酸相似性为95.4%～99.8%和94.0%～100%。任丹等[16]分离到1株鹅源TMUV全基因组序列与国内DTMUV相似性最高达97.7%，与鹅源TMUV相似性为96.7% 左右。胡峰等[17]分离的2株水禽源TMUV，与参考毒株的相似性大于95.7%，E基因与参考毒株的核苷酸相似性为95.2%以上。李刚[18]分离的山东DTMUV毒株与2017年分离株的ORF氨基酸相似性为98%以上；与2010―2012年分离株的氨基酸相似性为96.8%～98.6%。农海连[19]从广西分离的4株DTMUV与参考毒株的核苷酸相似性高于96%，氨基酸相似性高于98%。刘烈发等[20]从江西省某蛋鸭养殖场分离到1株DTMUV，与已报道的DTMUV参考毒株核苷酸相似性在98.5%以上。李文俊等[21]从鸭组织病料中分离出1株DTMUV，其E基因与DTMUV参考毒株相似性最高达99.2%，与鸡源TMUV毒株相似性为86.7%。以上表明，国内DTMUV毒株之间的相似性普遍较高，与本研究的分析结果相似，说明国内DTMUV毒株遗传变异较小。

水禽源、鸡源及蚊虫源TMUV的ORF遗传进化树可分为4个进化群，GXQZ01-DTMUV-2020株与GX2012、GX2013E株等组成2.1亚群；GX2011、GX2015株与国内主要DTMUV组成2.2亚群，这是国内DTMUV优势群体；马来西亚毒株组成TMUV群；山东SD14株为3群；泰国DK/TH/CU-DTMUV2007株为1群。广西DTMUV有3株位于2.1亚群，2株位于2.2亚群，从毒株分离年份上尚未发现相关性。GXQZ01-DTMUV-2020株与DTMUV/Goose/CHN/2019/AQ-19和CHN-YC处于同一进化分支上，遗传关系距离最近，这与相似性分析结果一致。GX2012、GX2013E株和重庆CQW1株处于相邻进化分支上，GX2011、GX2015株与广东FS-2011株处于同一进化分支。并且，GXQZ01-DTMUV-2020株与广西其他4株DTMUV遗传关系较远，呈现不同的进化趋势。E基因的遗传进化树中，GXQZ01-DTMUV-2020株与2.2亚群的优势毒株遗传距离比GX2012、GX2013E更远，这与ORF和NS1不同。NS1遗传进化趋势与ORF相似。PENG等[22]对国内外TMUV毒株进行遗传进化分析，其中广西毒株的分群结果与本研究一致。NINVILAI等[23]对2015―2017年分离的泰国DTMUV毒株进行遗传特征分析，GX2013E处于2.1亚群，绝大多数中国DTMUV毒株位于2.2亚群。农连海[19]分离的4株广西DTMUV毒株，遗传进化分支上与CQW1遗传关系最近，这与本研究结果一致。综上，广西DTMUV毒株呈现不同的遗传进化趋势，表现遗传多样性的特征。

DTMUV全基因组序列重组分析发现，共有4株存在重组现象。其中，HB2016和AH2014重组的位点相似，位于E、NS1及NS2A基因，CHN-YC重组的位点位于E基因，HD2-2013重组的位点位于NS3、NS4A和NS4B基因。E蛋白作为宿主的重要保护性抗原，在病毒复制过程中，对病毒的吸附、融合及受体结合等发挥着至关重要的作用[7,24]。非结构蛋白在病毒核酸的复制、蛋白的合成加工与病毒粒子组装等方面起关键性作用[25]。因此，这些基因发生重组，须引起密切关注。DAI等[26]利用RDP 4软件检测到一株DTMUV发生重组，重组位点位于prM和E基因。本研究对ORF、E及NS1基因遗传进化速率估算的结果为1.146×10-3，1.467×10-3，1.319×10-3替换/(位点·年)。NINVILAI等[23, 27]对亚洲DTMUV毒株的ORF、E基因遗传进化速率估算结果为1.113×10-3，1.507×10-3替换/(位点·年)。YU等[28]对DTMUV的E基因进化速率评估结果为5×10-4替换/(位点·年)。DAI等[27]对TMUV全基因组序列遗传进化速率估算结果为5.9×10-4替换/(位点·年)。

综上，同一个基因或片段的进化速率估算结果有差异，可能与选择的参考毒株种类、数量及软件参数设置等因素有关。因此，须进一步加强DTMUV流行情况调查及基因组分子结构分析，为DTMUV的有效防控提供数据支持。