非酒精性脂肪性肝病患者髓源性抑制细胞和白介素-6的初步研究

庄静华，李明凯，陈式仪，王贷明

（1.汕头市中心医院风湿科，广东 汕头 515041；2.中山大学第三附属医院消化内科，广东 广州 510000；3.汕头大学医学院第二附属医院内分泌与风湿科，广东 汕头 515041；4.汕头大学医学院第二附属医院心内科，广东 汕头 515041）

非酒精性脂肪性肝病（non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）是一种无过量饮酒和其他明确的肝损害因素所致的、以肝实质细胞脂肪变性为特征的临床病理综合征。NAFLD 根据肝脏病理学形态的不同，分为非酒精性肝脂肪变、非酒精性脂肪性肝炎（non-alcoholic steatohepatitis，NASH）、肝硬化和肝细胞癌[1]。髓源性抑制细胞（myeloid-derived suppressor cells，MDSC） 存在于大多数癌症患者中，它是一群位于B细胞、T细胞上游的免疫调节细胞，包括早期髓系祖细胞和不成熟的粒细胞、单核巨噬细胞、树突状细胞等。在正常情况下，骨髓中的造血干细胞分化为未成熟髓样细胞，进一步分化为成熟的粒细胞、巨噬细胞或树突状细胞，但在感染、肿瘤、器官移植或炎症性疾病等病理状态下，未成熟髓样细胞分化受阻并失去分化能力，即成为MDSC[2]。MDSC分为单核型MDSC（monocytic-MDSC，Mo-MDSC）和多核型/粒细胞型 MDSC （granulocytic-MDSC，G-MDSC)。MDSC 与肝脏炎症、纤维化和肝细胞癌的发病机制有关[3-4]。白介素-6（interleukin-6，IL-6）被认为可抑制氧化应激和线粒体功能紊乱，从而保护肝脏，而肝细胞与周围脂肪细胞也能分泌IL-6，IL-6 又能介导和促进巨噬细胞浸润，在NAFLD 的发生发展中发挥重要作用[5]。目前MDSC 在NAFLD 患者中的表达情况研究较少，MDSC 是否影响NAFLD 进展为肝细胞癌也未见相关报道。本研究探讨NAFLD 患者外周血中MDSC和IL-6的表达及意义。

1 资料与方法

1.1 研究对象

选取2018—2019 年在汕头大学医学院第二附属医院就诊的NAFLD 患者30 例（NAFLD 组）和同期健康体检者30 名（正常对照组）。NAFLD 患者均符合《非酒精性脂肪性肝病防治指南（2018更新版）》[1]中的相关诊断标准：（1）无过量饮酒史（男性饮酒折合乙醇量＜30 g/d，女性＜20 g/d）；（2）具有弥漫性肝细胞脂肪变的影像学或组织学证据。排除标准：（1）全胃肠外营养、病毒性肝炎、药物性肝炎、自身免疫性肝病、肝豆状核变性等可导致脂肪性肝病的特定疾病；（2）伴有感染（慢性乙型肝炎、肺结核等）、恶性肿瘤、自身免疫性疾病（1型糖尿病、桥本甲状腺炎、炎症性肠病等）、严重心肺疾病、严重肾功能不全等。本研究经汕头大学医学院第二附属医院伦理委员会审查批准，所有研究对象均签署知情同意书。

1.2 主要试剂和仪器

抗人HLA-DR-APC 抗体、抗人CD11b-PC5抗体、抗人CD33-PE 抗体、抗人CD14-FITC 抗体及IgG 同型对照均购自美国Biolegend 公司，IL-6和酶联免疫检测试剂盒购自英国Abcam 公司，EPICS XL 流式细胞仪购自美国贝克曼库尔特公司，EnSpire酶标仪购自美国PerkinElmer公司。

1.3 研究方法

1.3.1 外周血单个核细胞的分离收集所有研究对象空腹状态下肘静脉血2 mL，置于EDTA 抗凝管中。取100 μL人外周血，加入2 mL流式细胞分析用溶血素，冰浴10 min，350×g离心5 min；弃上清，加入10 mL 磷酸盐缓冲液洗细胞1 次，350×g离心5 min，弃上清后，重悬计数。

1.3.2 流式细胞术将新鲜分离的外周血单个核细胞浓度调整为1×107个/mL，每管100 μL，加入相应的表面标记抗体（CD14、CD33、CD11b、HLA-DR），混匀后室温避光孵育30 min。加入2 mL 的细胞染色缓冲液重悬细胞，350×g离心5 min，弃上清，加入0.1 mL的细胞染色缓冲液重悬细胞，在1 h 内上流式细胞仪检测。以CD11b+CD33+HLA-DR-定义为MDSC，CD11b+CD14-CD33+HLA-DR-定 义 为 G-MDSC，CD11b+CD14+CD33+HLA-DR-定义为Mo-MDSC。采用FlowJo软件分析MDSC、G-MDSC、Mo-MDSC 占外周血单个核细胞的比例。

1.3.3 血清中IL-6的检测收集NAFLD组和正常对照组研究对象空腹状态下肘静脉血3 mL，置于非抗凝管中，3 000 r/min离心10 min，吸取血清分装于无菌管中，按照酶联免疫吸附测定试剂盒说明书的操作步骤检测IL-6的浓度。

1.4 统计学方法

应用SPSS 19.0统计软件进行分析。正态分布的计量资料以表示，组间比较采用独立样本t检验；非正态分布的计量资料以中位数和四分位数 间 距 [M（Q1，Q3）]表 示 ， 组 间 比 较 采 用Mann-WhitneyU检验。采用Spearman 相关分析判断MDSC 及其亚型、IL-6 与丙氨酸转氨酶、天冬氨酸转氨酶等临床指标的关系。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 NAFLD 组和正常对照组基本的器官功能指标和临床实验指标的差异情况

NAFLD 组男性15 例，女性15 例，年龄64（50，75），正常对照组男性14例，女性16例，年龄27（24，41）。NAFLD 组和正常对照组年龄、白细胞计数、淋巴细胞百分比、中性粒细胞百分比、嗜酸性细胞百分比、嗜碱性细胞百分比、血红蛋白、红细胞压积差异有统计学意义（P值均＜0.05），见表1。

表1 NAFLD组和正常对照组基本的器官功能指标和临床实验指标的差异情况（n=30例）

2.2 MDSC、Mo-MDSC、G-MDSC 和IL-6 在NAFLD组和正常对照组外周血中的表达情况

与正常对照组对比，NAFLD 患者外周血单个核细胞中MDSC、Mo-MDSC、G-MDSC 的比例均降低（P值均＜0.05），IL-6 的表达水平升高（P＜0.001），见表2。

表2 MDSC、Mo-MDSC、G-MDSC、IL-6在NAFLD组和正常对照组外周血中的表达情况［n=30例，M（Q1，Q3）］

2.3 NAFLD 患者外周血MDSC、Mo-MDSC、G-MDSC、IL-6与临床实验室检查指标的相关性

G-MDSC 比例与丙氨酸转氨酶/天冬氨酸转氨酶 （alanine aminotransferase/ aspartate aminotransferase，ALT/AST） 呈 负 相 关 （r=-0.403，P=0.030）；G-MDSC与体重指数、AST、ALT、甘油三酯、低密度脂蛋白等其他指标间无相关性（P值均＞0.05）；MDSC、Mo-MDSC、IL-6 与临床实验室各检查指标间无相关性 （P值均＞0.05）。NAFLD 患者外周血中MDSC、Mo-MDSC、G-MDSC 比例与IL-6的表达水平均无相关性。见表3。

表3 NAFLD患者外周血中G-MDSC与临床实验室检查指标的相关系数

3 讨论

目前，国际范围内MDSC 与NAFLD 的相关性研究较少，大多数以小鼠为研究对象且尚无定论。在动物模型方面，Chen 等[6]发现与正常对照组小鼠相比，高脂饮食诱导产生的NAFLD小鼠肝脏组织中MDSC 的比例明显增加。Yao 等[7]发现NAFLD 模型小鼠肝脏非实质细胞中的MDSC 比例比正常对照组高。Li等[8]发现胆碱缺乏氨基酸限制饮食诱导的NASH模型小鼠骨髓中的MDSC比例较正常对照组显著升高（P＜0.05），肝组织中MDSC比例较正常组显著降低（P＜0.001），外周血中MDSC 的比例与正常组相比差异无统计学意义（P＞0.05）。本研究发现 NAFLD 患者外周血中MDSC 比例比正常对照组明显减少（P＜0.05）。这可能是一种“归巢现象”，即在NAFLD 的慢性病程中，骨髓产生的MDSC 通过血液被募集到炎症部位肝脏中，导致外周血中的MDSC 数量减少，而肝脏中的MDSC 数量增加。但也不排除其他的可能：（1）由于研究中样本量小，不能很好地反映样本总体的情况；（2）可能存在其他机制，比如在病情很严重时，MDSC 的生成反而受抑制，从而导致MDSC数量下降。

本研究中NAFLD 组和正常对照组外周血中MDSC 均 以 Mo-MDSC 为 主 ， 且 NAFLD 组 的Mo-MDSC和G-MDSC比例皆较正常对照组明显减少 （P＜0.05），这提示 Mo-MDSC、G-MDSC 可能都参与了NAFLD的疾病过程，但两者的功能可能存在差异，G-MDSC 可能发挥主要作用。本研究发现G-MDSC 比例与ALT/AST 负相关，而ALT/AST上升常见于NASH患者，且与炎症程度关系密切。Cheng 等[9]发现在高脂饮食和蛋氨酸胆碱缺乏饮食诱导小鼠NASH 模型中，苍菊清肝降脂汤治疗使肝损伤基本恢复正常，降低了ALT/AST 水平，减轻了肝脏炎症的严重程度。Mridha 等[10]发现MCC950 治疗使肝组织表达caspase-1 和IL-1β，血浆中IL-1β、MCP1、IL-6、ALT/AST 水平降低，肝脏炎症和肝纤维化程度减轻。究竟是G-MDSC 比例的降低影响了疾病的进程还是疾病的加重促进了G-MDSC 比例的降低呢？如果是后者的话，G-MDSC 比例的降低又进一步对疾病产生了怎样的影响，是免疫促进还是免疫保护？这都有待进一步研究。

炎症虽然是肝脏疾病的常见原因，但其在NASH 发病机制中的作用仍不清楚。有报道称，相对过量的促炎性细胞因子和相对缺乏的抗炎细胞因子之间的不平衡在NASH 的发病机制中起到关键的作用[11]。IL-6 可由单核细胞、巨噬细胞等多种细胞产生，与肝脏局部炎症有关。IL-6 参与炎症损伤过程，具有抑制脂肪分解和脂蛋白酯酶活性、促进脂肪生成的作用[12]。本研究发现NAFLD患者外周血中IL-6表达水平较正常人明显增加（P＜0.001），与其他文献结果一致，提示了IL-6 可能与NAFLD的发生密切相关。

研究表明，在炎症或肿瘤中，机体中多种细胞因子能够影响MDSC 的募集、生长和分化。γ干扰素、IL-6、IL-10、IL-13 和 TGF-β3 能刺激MDSC 的募集和扩增，γ 干扰素、IL-4、IL-13、IL-17和转化生长因子-β则刺激MDSCs 的活化[13]。关于 NAFLD 中 MDSC 与 IL-6 关系的研究甚少，目前只有动物模型的研究，尚未有关于人的研究。

综上所述，本研究发现MDSC 及其亚型Mo-MDSC、G-MDSC在NAFLD患者外周血单个核细胞中的比例减少，而IL-6 表达增加，对此我们推测IL-6 可能促进MDSC 迁移到靶器官肝脏中，导致外周血MDSC 的比例减少。遗憾的是，并未发现MDSC 或其亚型与IL-6 相关，可能是由于本研究中的例数相对较少，造成了一定的抽样误差，也未能做到以疾病严重程度分组。MDSC 与IL-6之间的关系还有待进一步研究。