LncRNA XIST调控miR-200b/ZEB1轴参与儿童急性髓系白血病阿柔比星耐药的机制研究①

金 亚 张教国（滕州市中心人民医院儿科，滕州 277500）

急性白血病是儿童常见恶性肿瘤之一，其中急性髓系白血病（acute myeloid leukemia，AML）是其中的重要亚型，是导致白血病患儿死亡的主要原因。AML的治疗主要包括联合化疗及造血干细胞移植，但白血病细胞易对化疗药物产生耐药性，极大影响治疗效果，降低患儿生存率［1-3］。miR-200b是miR-200家族成员，能参与介导细胞自我更新、分化、增殖与凋亡过程，在卵巢癌、肝癌、AML中异常低表达，上调其表达，可抑制卵巢癌细胞增殖及肝癌组织血管生成，具有抑癌作用［4-6］；ZEB1基因可促进癌细胞迁移过程中的上皮间充质转化作用，在乳腺癌、AML中高表达，可作为AML诊断和预后的标志物，miR-200b可显著降低ZEB1的表达，抑制乳腺癌细胞侵袭转移，并减弱癌细胞的抗雌激素类抗癌药三苯氧胺耐药性［7-8］，因而miR-200b/ZEB1轴可能也是改善阿柔比星耐药的潜在作用靶点。LncRNA XIST是直接靶向调控miR-200b-3p表达的长链非编码RNA，在肝癌、AML中表达明显增高，沉默LncRNA XIST基因后，miR-200b-3p表达增强，肝癌细胞生长及体内肿瘤形成受到抑制，并可抑制AML细胞活性与阿霉素耐药性，促进其凋亡［9-10］。但LncRNA XIST是否可以调控miR-200b/ZEB1轴进而影响AML阿柔比星耐药性目前尚不清楚，本文通过建立人AML阿柔比星耐药细胞株K562/ADM，并对此进行初步探索。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1试剂与细胞 人AML细胞系K562、RPMI-1640培养基、特级胎牛血清购自上海继和生物科技有限公司；阿柔比星购自深圳振强生物技术有限公司；SYBR Premix Ex TaqTMⅡ、LipofectamineTM2000、Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒（CA1050）、CCK-8试剂盒、BCA蛋白浓度测定试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司；miR-200b、U6、LncRNA XIST、GAPDH、ZEB1及 多 药 耐 药1（multidrug resistance 1，MDR1）引物购自生工生物工程（上海）股份有限公司；LncRNA XIST inhibitor、LncRNA XIST inhibitor阴性对照购自上海吉玛制药技术有限公司；兔源ZEB1一抗、兔源P-糖蛋白（P-glycoprotein，P-gp）一抗购自美国Abcam公司。

1.1.2主要仪器HBS-1096C酶标仪购自南京德铁实验设备有限公司；BriCyte E6流式细胞仪购自深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司；QuantStudio 6 Flex实时荧光定量PCR系统购自赛默飞世尔科技（中国）有限公司；1658033小型垂直电泳转印系统购自美国Bio-Rad公司。

1.2方法

1.2.1人AML阿柔比星耐药细胞株K562/ADM建立 将购买的人AML细胞株K562复苏，以RPMI-1640培养基+10%胎牛血清+1%双抗接种培养，以终浓度0.01、0.05、0.1、0.5、1、5 µg/ml［11］的阿柔比星依次处理K562细胞各24 h，直至细胞在5 µg/ml的阿柔比星中稳定生长，即获得人AML阿柔比星耐药细胞株K562/ADM。

1.2.2K562及K562/ADM细 胞中LncRNA XIST水平检测 取K562及K562/ADM细胞传代培养，提取细胞总RNA，逆转录实验得到模板cDNA，使用2×SYBR Premix Ex TaqTMⅡ进行qRT-PCR反应，具体步骤及反应条件设定参照说明书进行，运用算法2-ΔΔCt分析所得数据，得出LncRNA XIST相对表达水平，引物序列见表1。

表1 qRT-PCR引物序列Tab.1 qRT-PCR primer sequences

1.2.3细胞分组转染及标本收集 取K562/ADM细胞传代，于24孔培养板中接种培养，细胞贴壁后，随机分为对照组、LncRNA XIST inhibitor组、阿柔比星+LncRNA XIST inhibitor阴性对照组、阿柔比星+LncRNA XIST inhibitor组，参照文献［10］和说明书，以LipofectamineTM2000分组转染LncRNA XIST inhibitor、LncRNA XIST inhibitor阴性对照，并以Opti-MEM减血清培养基培养6 h，更换新的细胞培养液，同时以5µg/ml的阿柔比星处理，24 h后收集各组细胞，重复3次，收集3份细胞标本。

1.2.4细胞增殖检测 取K562/ADM细胞传代接种于96孔培养板，按照1.2.3中方法分组转染并处理（每组6个重复孔），另选6个孔不接种细胞作为空白对照组，24 h后更换新的细胞培养液，同时加入CCK-8试剂，采用酶标仪测得2 h后各孔吸光度（450 nm波长），记为A值，计算细胞存活率（%）=（A实验组-A空白对照组）/（A对照组-A空白对照组）×100%。

1.2.5细胞凋亡检测 取1.2.3中收集的各组细胞标本1份，加入PBS重悬、计数，取含约1×106个细胞的细胞悬浮液离心，洗涤细胞沉淀后，以Annexin V-FITC 10 µl、PI 5 µl避光孵育，离心、洗涤细胞沉淀，重悬，混匀后上机检测细胞凋亡情况。

1.2.6细 胞LncRNA XIST、miR-200b及ZEB1、MDR1 mRNA水平检测 取1.2.3中收集的各组细胞标本1份，按照1.2.2中方法进行qRT-PCR实验，选用GAPDH作LncRNA XIST、ZEB1、MDR1的内参基因，选用U6作miR-200b的内参基因，运用算法2-ΔΔCt分析所得数据，得出各基因mRNA相对表达水平，引物序列见表1。

1.2.7细胞ZEB1和P-gp蛋白表达检测 取1.2.3中收集的各组细胞标本1份，提取总蛋白后测量其浓度，并调至各组相同后煮沸，取各组蛋白样品液20µl，110 V恒压下电泳90 min，接着同样电压下湿转90 min，所得硝酸纤维素膜封闭后，截下β-actin、P-gp、ZEB1三条目的条带，孵育一抗，洗膜，孵育二抗，洗膜，显色，拍摄，在Image J软件中打开蛋白条带图片，定量分析各蛋白灰度值，最终获得目的蛋白相对表达量。

1.3统计学分析 实验计量数据采用±s表示，输入SPSS24.0软件进行统计分析，组间差异比较行单因素方差分析，进一步两两之间比较行LSD-t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1LncRNA XIST在AML细 胞K562及AML耐 药细胞K562/ADM中的表达 与K562细胞相比，Lnc-RNA XIST在K562/ADM细胞中表达明显升高（P＜0.05），见表2。

表2 K562和K562/ADM细胞中LncRNA XIST水平（±s，n=6）Tab.2 LncRNA XIST levels in K562 and K562/ADM cells（±s，n=6）

表2 K562和K562/ADM细胞中LncRNA XIST水平（±s，n=6）Tab.2 LncRNA XIST levels in K562 and K562/ADM cells（±s，n=6）

Note：Compared with K562 cells，1）P＜0.05.

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2.2各组细胞存活率 与对照组相比，阿柔比星+LncRNA XIST inhibitor组细胞存活率明显降低（P＜0.05），LncRNA XIST inhibitor组、阿柔比星+Lnc-RNA XIST inhibitor阴性对照组细胞存活率无明显改变（P＞0.05）；与LncRNA XIST inhibitor组相比，阿柔比星+LncRNA XIST inhibitor组细胞存活率明显降低（P＜0.05），见表3。

表3 各组细胞存活率（±s，n=6）Tab.3 Cell survival rate of each group（±s，n=6）

表3 各组细胞存活率（±s，n=6）Tab.3 Cell survival rate of each group（±s，n=6）

Note：Compared with control group，1）P＜0.05；compared with Lnc-RNA XIST inhibitor group，2）P＜0.05.

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2.3各组细胞凋亡率 与对照组相比，阿柔比星+LncRNA XIST inhibitor组细胞凋亡率明显升高（P＜0.05），LncRNA XIST inhibitor组、阿柔比星+Lnc-RNA XIST inhibitor阴性对照组细胞凋亡率无明显改变（P＞0.05）；与LncRNA XIST inhibitor组相比，阿柔比星+LncRNA XIST inhibitor组细胞凋亡率明显升高（P＜0.05），见图1、表4。

表4 各组细胞凋亡率（±s，n=6）Tab.4 Apoptosis rate of each group（±s，n=6）

表4 各组细胞凋亡率（±s，n=6）Tab.4 Apoptosis rate of each group（±s，n=6）

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图1 流式细胞仪检测各组细胞凋亡情况Fig.1 Apoptosis was detected by flow cytometry

2.4各组细胞LncRNA XIST、miR-200b及ZEB1、MDR1 mRNA表达水平 与对照组、阿柔比星+Lnc-RNA XIST inhibitor阴性对照组分别相比，阿柔比

Note：Compared with control group，1）P＜0.05；compared with Lnc-RNA XIST inhibitor group，2）P＜0.05.星+LncRNA XIST inhibitor组、LncRNA XIST inhibitor组LncRNA XIST、ZEB1及MDR1 mRNA表达水平明显降低（P＜0.05），miR-200b表达水平明显升高（P＜0.05）；阿柔比星+LncRNA XIST inhibitor阴性对照组细胞各指标无明显改变（P＞0.05），见表5。

表5 各组细胞LncRNA XIST、miR-200b及ZEB1、MDR1 mRNA表达水平（±s，n=6）Tab.5 Expression levels of LncRNA XIST，miR-200b，ZEB1 and MDR1 mRNA in cells of each group（±s，n=6）

表5 各组细胞LncRNA XIST、miR-200b及ZEB1、MDR1 mRNA表达水平（±s，n=6）Tab.5 Expression levels of LncRNA XIST，miR-200b，ZEB1 and MDR1 mRNA in cells of each group（±s，n=6）

Note：Compared with control group，1）P＜0.05；compared with Ararubicin+LncRNA XIST inhibitor negative control group，2）P＜0.05.

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2.5各组细胞ZEB1及P-gp蛋白表达水平 与对照组、阿柔比星+LncRNA XIST inhibitor阴性对照组分别相比，阿柔比星+LncRNA XIST inhibitor组、Lnc-RNA XIST inhibitor组细胞ZEB1、P-gp蛋白表达水平明显降低（P＜0.05），阿柔比星+LncRNA XIST inhibitor阴性对照组细胞ZEB1、P-gp蛋白表达水平无明显改变（P＞0.05），见图2、表6。

图2 各组细胞ZEB1、P-gp蛋白相对表达的比较（±s，n=6）Fig.2 Comparison of relative expression of ZEB1 and Pgp proteins in cells of each group（xˉ±s，n=6）

表6 各组细胞ZEB1、P-gp蛋白相对表达的比较（xˉ±s，n=6）Tab.6 Comparison of relative expression of ZEB1 and P-gp proteins in cells of each group（xˉ±s，n=6）

3 讨论

AML可引发造血细胞发育停滞，丧失正常造血功能，并恶性增殖，造成严重贫血，极大威胁儿童的生命安全，目前化疗是其主要治疗方式，但因耐药性的存在，其疗效有限，预后较差，亟需寻找减轻AML耐药性，提高疗效的方法［12-13］。本实验以阿柔比星浓度递增法诱导建立人AML阿柔比星耐药细胞株K562/ADM，显示K562细胞在5 µg/ml的阿柔比星中生长良好，无明显凋亡产生，表明阿柔比星耐药细胞株K562/ADM构建成功。

LncRNA XIST在多种肿瘤组织中异常过表达，包括非小细胞肺癌、乳腺癌、AML等，具有致癌作用，有助于癌细胞耐药性产生，敲除LncRNA XIST基因，可促进非小细胞肺癌细胞凋亡，抑制增殖，提高对顺铂的化疗敏感性，显著抑制乳腺癌细胞的迁移侵袭活 性，诱导其凋亡［10，14-16］。miR-200b-3p是Lnc-RNA XIST的直接作用靶点，体内外沉默肝癌组织中LncRNA XIST，可显著上调miR-200b-3p表达，抑制肝癌细胞增殖，且研究表明，miR-200b具有抑癌作用，在AML患者中表达显著降低，与白细胞明显升高及预后差有关［6，9，17］；ZEB1有助于癌细胞化疗耐药性的发生，是miR-200b的下游因子，可被其负调控［18-20］，因而推测LncRNA XIST可能通过调控miR-200b/ZEB1轴影响儿童AML的阿柔比星耐药性。本实验结果显示，LncRNA XIST在K562/ADM细胞中表达相比K562细胞明显升高，以LncRNA XIST inhibitor敲低K562/ADM细胞中LncRNA XIST表达，可明显下调ZEB1及MDR1 mRNA表达、ZEB1及P-gp蛋白表达、耐药基因MDR1 mRNA表达水平及耐药蛋白P-gp表达水平，上调miR-200b表达，并可明显降低在阿柔比星处理基础上细胞存活率，并提高其凋亡率，表明LncRNA XIST参与介导AML耐药性的产生过程，下调LncRNA XIST表达，可上调miR-200b表达，下调ZEB1及耐药基因的表达，显著增强K562/ADM细胞对阿柔比星的化疗敏感性，降低阿柔比星处理时AML耐药细胞K562/ADM活力，促使其凋亡，减轻其耐药性，增强化疗药物阿柔比星对K562/ADM的杀伤能力。

综上所述，LncRNA XIST促使人AML细胞阿柔比星耐药性产生，敲低其表达，可促使miR-200b表达，降低ZEB1及耐药基因的表达，减弱AML细胞的耐药性，增强阿柔比星对其的杀伤作用，从而减弱AML细胞活力，促使凋亡产生，表明LncRNA XIST是减轻AML化疗耐药性的一个作用靶点，调控miR-200b/ZEB1信号可能是其发挥作用的分子机制，但本实验还未通过过表达及敲除miR-200b基因进行对照验证，还需后续更深入的研究。