人工合成抗菌肽在龋病防治中的研究进展

袁文锦，韩佳岐，杨 婕，董 宁，姜 秋

龋病是世界范围内主要的公共卫生问题之一，具有发病率高、分布广泛等特点[1]。但常用的龋病防治药物如氯己定和氟化物，可能会引起细菌耐药性、牙齿变色等不良反应[2]。近年来，抗菌肽因其抗菌谱广、抗菌活性高、作用机制特殊而被认为是传统抗菌药物的替代品[3]。然而，大多数天然抗菌肽由于序列长度较长导致结构不稳定，在复杂的口腔环境其抗菌活性会进一步降低[4]。因此，研究人员以天然抗菌肽为模板设计出了具有更高抗菌活性和稳定性的人工合成抗菌肽[5]，为龋病防治提供了更多的选择。

1 人工合成抗菌肽的抗菌作用及机制

致龋菌通过产酸打破牙齿表面矿化平衡，从而诱导牙体硬组织脱矿，最终导致龋病的发生[6]。致龋菌包括多种细菌，其中变异链球菌因其产酸能力、耐酸性和促进细菌定植于牙齿表面的能力较强，而被认为是主要致龋菌[7]。已知的能够抑制变异链球菌的天然抗菌肽有环状细菌素、富组蛋白5(Histatin5，H5)、乳铁蛋白、GHa、LL-37和石榴提取物等，研究人员根据抗菌肽的作用机制设计并合成了一系列性能得到优化的人工合成抗菌肽。

1.1 以天然抗菌肽为模板设计的人工合成抗菌肽

LN-7、LR-10、AT-7和KR-1都是以天然抗菌肽为模板根据两亲性和阳离子性设计合成的新型抗菌肽，其中LN-7、LR-10和AT-7以环状细菌素reuricin 6或gassericin A为模板[7-9]，KR-1以富组蛋白5为模板[10]。新型抗菌肽的阳离子性和疏水性都有所增强，研究表明抗菌肽的疏水性与抗菌活性呈正相关[8]，所以新型抗菌肽对变异链球菌具有更强的抑制作用。此外，KR-1还能够抑制其他致龋菌，如远缘链球菌(S.sobrinus)和戈登链球菌(S.gordonii)[10]。

GHaR衍生肽是以GRaR为模板设计合成的新型抗菌肽。GHaR具有显著的抗菌活性，但溶血作用较强，因此通过氨基酸替换降低表面疏水性得到了GHaR6R、GHaR8R和GHaR9R[11]，研究表明，通过降低多肽表面疏水性，能够降低其溶血毒性[12]。除GHaR9R外，其他类似物均表现出良好的抗菌活性和抗生物膜活性，但由于GHaR7R表现出较强的溶血性和细胞毒性[11]，所以GHaR6R、GHaR8R和GHaR9W有望成为龋病防治的新药物。

LF-1是以乳铁蛋白为模板设计合成的抗菌肽，研究表明乳铁蛋白N-端的螺旋帽残基(GKLI)能够稳定α-螺旋结构，从而在抗菌活性中起关键作用[13]。通过在LF-1的N端添加螺旋帽序列，获得LF-2[14]。LF-1和LF-2均对变异链球菌有很强的抗菌活性，但由于螺旋帽序列使LF-2的二级结构更稳定，使其对多种细菌均具有较强的抑制作用[14]。

IG-13-1、IG-13-2和[W7]KR12-KAEK都是以抗菌肽LL-37为模板合成的新型抗菌肽。通过缩短LL-37的长度、改变其电荷和疏水性合成了具有更强抗菌活性的IG-13-1和IG-13-2[15]。截取抗菌肽LL-37中第18～29个氨基酸得到KR-12[16]，由于抗菌肽的长度需要与脂质双层厚度相匹配才能够形成稳定的孔状结构[17]，因此在KR-12的C末端添加赖氨酸-丙氨酸-谷氨酸-赖氨酸(KAEK)序列，合成了具有更强抗菌作用的新型抗菌肽[W7]KR12-KAEK[17]。

PUG-1是以石榴提取物为模板设计合成的抗菌肽[18]，DPS-PI是通过将二磷酸丝氨酸结合到PI上得到的新型抗菌肽[19]。PUG-1和DPS-PI对变异链球菌均具有较强的抑制作用。

1.2 特异性靶向抗菌肽

特异性靶向抗菌肽是一种新型抗菌肽，由抗菌区域、靶向定位区域和连接体组成[20]。最小抑菌浓度(minimal inhibit concentration，MIC)、最小杀菌浓度(minimum bactericidal concentration，MBC)结果显示新型特异性靶向抗菌肽C8gpm11对变异链球菌的杀菌效果最好，敏感度最强[21]。

1.3 根据抗菌机制设计的人工合成抗菌肽

GH12和G(IIKK)3I-NH2(简称G3)都是根据两亲性和阳离子性α-螺旋结构设计出的抗菌肽，均对变异链球菌有较强的抑制作用。此外，在大鼠龋病模型中GH12还能够减少其他致龋菌的数量，如罗氏菌属(Rothia)[22]，罗氏菌属通常与龋病有关，并有助于其他致龋菌的黏附[23]。由于GH12富含组氨酸，而组氨酸在酸性环境中会变为阳离子[24]，因此在pH值为5.5时，GH12与细胞膜上阴离子的相互作用增强，从而达到更好的抗菌效果[25]。

C10-KKWW是以ptxA为靶点设计合成的抗菌肽，变异链球菌通过磷酸烯醇式丙酮酸-糖磷酸转移酶(PTS)系统识别碳水化合物并将其转移到细胞内从而获得能量[26]，ptxA是PTS系统中重要的组成部分。对比C10-KKWW对野生型变异链球菌(WT)、ptxA缺失突变株(ΔptxA)和补充型ptxA突变株(CptxA)的抗菌活性，C10-KKWW对ΔptxA的抗菌活性和生物膜去除能力较弱，表明C10-KKWW以ptxA为靶点抑制变异链球菌[27]。

1.4 抗菌机制

1.4.1 破坏细胞膜完整性 抗菌肽中带有正电荷的氨基酸会通过静电作用结合到带负电荷的细菌细胞膜上，然后通过在脂质双层中插入疏水部分破坏细胞膜导致细菌因内容物泄漏而死亡[8,11,28]。电镜结果显示使用抗菌肽会导致变异链球菌细胞膜完整性被破坏，表面呈现微孔样改变[17,21]。

1.4.2 减少致龋毒力因子合成 抗菌肽能够通过减少致龋菌毒力因子的合成来抑制龋病发生[29]。GH12能够在体外抑制乳酸脱氢酶(LDH)形成[30]，LDH是糖酵解过程中最重要的酶之一，缺乏LDH意味着变异链球菌通过糖酵解产酸的能力降低，最终导致致龋性降低。

2 人工合成抗菌肽的抗生物膜作用

牙菌斑生物膜是龋病发生的始动因子[31]，与高龋病风险有关[32]。变异链球菌生物膜是龋病研究中最常用的微生物模型[33]。清除菌斑生物膜是治疗龋齿的有效方法，然而成熟的菌斑生物膜由于其严密的三维网络结构、细胞外多糖(EPS)的保护、对环境变化的适应能力等原因难以去除[34]。生物膜的形成有几个阶段，包括细菌黏附、成熟阶段和扩散阶段[35]。抗菌肽在各个阶段都能发挥作用，使抗菌肽成为一种极具潜力的防龋药物。

2.1 具有抗生物膜作用的人工合成抗菌肽

研究表明，KR-1、GHaR衍生肽、IG-13-1、IG-13-2、[W7]KR12-KAEK、DPS-PI和G3等人工合成抗菌肽能够明显减少生物膜的形成，研究结果显示经上述抗菌肽处理后的生物膜疏松多孔，使后续的机械清除变得更加高效。

LR-10和PUG-1不仅能够抑制变异链球菌生物膜的形成，还能够快速穿透细胞外基质，进入生物膜内杀死变异链球菌[8,18]。

动物实验结果表明LF-1和LF-2均能显著降低平滑面龋和窝沟龋的发生率。两种多肽在体内的防龋效果可以与常规防龋药物氟化钠和氯己定相媲美[14]。

GH12对变异链球菌生物膜、人牙菌斑来源的多菌种生物膜的乳酸生成、水不溶性EPS的合成和酸化能力有明显抑制作用，并且能够破坏生物膜的支架结构[22,36-37]。在pH为5.5时，GH12对生物膜的抑制作用更加明显[25]。此外，GH12 还能够选择性抑制多菌种生物膜中主要致龋菌变异链球菌的机会性过度生长，从而使牙菌斑生物膜组成趋向于健康状态，有利于预防龋齿的发生[37-38]。

2.2 抗生物膜机制

细菌在牙面上的黏附被认为是生物膜形成的关键步骤。抗菌肽通过附着在底物表面，作为屏障阻止细菌和底物之间的相互作用。牙齿经DPS-PI处理后，二磷酸丝氨酸与羟基磷灰石结合，唾液黏蛋白和变异链球菌很难替换二磷酸丝氨酸黏附到牙齿表面。扫描电子显微镜结果显示经DPS-PI处理后的釉质表面变异链球菌分布稀疏，兔切牙表面形成的牙菌斑生物膜也明显减少[19]。抗菌肽还能够与细菌结合，阻止细菌黏附到底物表面[3]。细菌表面疏水性因为和黏附在疏水表面的能力呈正相关，所以被认为是评价细菌黏附性的一个重要参数[39]，G3能够通过降低细菌表面疏水性抑制细菌黏附。同时，G3能够和胞外DNA(eDNA)相互作用，破坏成熟生物膜的3D结构，从而使其分散[3]。eDNA是变异链球菌生物膜细胞外基质的主要成分，作为刚性支架支撑其他细胞外基质最终形成成熟的生物膜[40]。荧光探针结果显示G3通过和细菌快速结合，导致细菌表面的负电荷在与带正电荷的G3结合时迅速减少[3]，由于细菌之间的静电斥力减少，细菌倾向于聚集在一起，减少在牙齿表面的黏附。

此外，抗菌肽能够通过减少与黏附相关的毒力因子的表达抑制生物膜形成。葡糖基转移酶(GTF)是变异链球菌的关键毒力因子之一，GTF可以催化细胞外多糖的合成[41]。细胞外多糖，特别是水不溶性葡聚糖对生物膜的形成和结构完整性非常重要，并为变异链球菌黏附提供结合位点[41]。G3、PUG-1和GH12均可以抑制编码水不溶性葡聚糖的基因gtfB的转录，减少水不溶性葡聚糖的产量[3,18,30]。

3 促进再矿化作用

致龋菌通过糖酵解产酸，局部酸化会破坏牙齿表面矿化平衡，诱导牙体硬组织脱矿[6]。减少牙体硬组织脱矿，同时诱导再矿化可以减少龋病的发生[42]。所以具有再矿化作用的抗菌肽对龋病防治意义重大。

3.1 具有再矿化作用的人工合成抗菌肽

研究表明通过将两个或多个肽连接在一起可能会从各个组分中获得不同的功能[43]。P-113-DPS和Sp-H5就是根据这种机制合成的具有抗菌作用和再矿化作用的多肽[44-45]。其中发挥抗菌作用的结构均取自于富组蛋白5[46]。Sp-H5选择整个H5作为抗菌基团，而P-113-DPS选择H5的最小片段P-113作为抗菌基团，P-113的正电荷能与阴离子脂磷壁酸和变异链球菌的肽聚糖相互作用，因此具有较高的抑菌活性[47-48]。磷酸丝氨酸(Sp)可以与羟基磷灰石结合，吸引游离钙离子(Ca2+)作为核启动矿化[44]。将Sp部分连接到H5的N端，构建出新型抗菌肽Sp-H5。在P-113的C-末端连接二磷酸丝氨酸得到P-113-DPS。

ICP-OES检测结果显示，有Sp-H5或P-113-DPS涂层的釉质切片钙、磷流失明显减少[44-45]。牙釉质表面暴露于再矿化溶液中，Sp-H5组的钙、磷含量显著增加，且矿化速度更快[44]。P-113-DPS组牙釉质表面有很厚的再生结晶层，再生层的晶体宏观结构为针状突起，微结构为六棱柱状突起，两者形态与天然牙釉质相似[45]。同时Sp-H5和P-113-DPS还有抑制变异链球菌及其生物膜的作用[44-45]。

含有邻苯三酚基团的没食子酸(GA)有诱导和加速矿化的作用[49]，可以与钙离子结合加速羟基磷灰石的再生[50]。将KR12与GA连接在一起得到了新型抗菌肽GA-KR12。傅里叶红外光谱分析结果表明GA-KR12可以减少牙本质脱矿和胶原降解。同时，GA-KR12能够促进釉质龋和人工牙本质龋的再矿化[28,42]。此外，GA-KR12能抑制浮游状态下的致龋菌包括变异链球菌、远缘链球菌、嗜酸乳杆菌的生长。

TD7在釉原蛋白-羟基磷灰石相互作用和釉质晶体定向生长中起着控制作用，它可以启动羟基磷灰石成核[51]。通过将TD7连接到GH12的N端得到了TDH19[52]。根据两亲性和正电荷原则替换TDH19中的氨基酸得到TVH19。由于含有TD7，TVH19表现出良好的体外再矿化活性，初期龋损经TVH19处理后表面显微硬度恢复率(SMHR%)较高，病变深度较浅，矿物质含量较高，再矿化作用与氟化钠之间无显著性差异[53]。此外，TVH19还具有抑制变异链球菌及其生物膜的作用[53]。

3.2 再矿化机制

4 展 望

研究人员在设计人工合成抗菌肽时应以功能为基础，具有靶向功能或再矿化功能的人工合成抗菌肽将成为未来抗菌肽设计的主要方向。在融合抗菌序列与功能序列时会影响抗菌肽的稳定性及生物安全性，如何筛选或设计出长度更短的抗菌序列和功能序列，以及在融合时保证其生物安全性将成为亟待解决的问题。