天然植保剂大蒜素的提取及保鲜效果研究

柴嫚青 ，李香香 ，王锐 ，张静静 ，田琳 ，徐晓萍 ,通信作者

（1. 天津农学院 基础科学学院，天津 300392；2. 华东理工大学 化学与分子工程学院，上海 200237）

大蒜中包含人体必需的微量元素硒、锌、锗等[1]，也包括脂溶性有机硫化物、硫代亚磺酸酯类等挥发性物质[2]和水溶性有机硫化物、类固醇皂苷等非挥发性物质等[3]。其中大蒜素是大蒜中最具有活性的物质，图1所示为大蒜素的结构[2]。大蒜素为淡黄色油状液体，有刺激性臭味。冷冻处理是所有试验预处理中最为稳定的处理方式，对大蒜的活性物质含量和抗氧化性影响微弱，可以作为工厂加工首要选择的处理条件[4]。大蒜适当延长采收时间有助于大蒜素的累积并且提高其辛辣度[5]。

图1 大蒜素结构

目前大蒜素的提取方法有水蒸气蒸馏法[6]、超临界 CO2提取法[7]和有机溶剂提取法[8]。本试验采用有机溶剂提取法，选用乙醇溶剂[9]，通过正交试验确定提取的最适宜条件，利用超声提取以提高提取率[10]。大蒜素含量的测定方法有定硫法[11]、硝酸汞法、吸光光度法和HPLC法[12]。本试验采用吸光光度法测定大蒜素含量，通过测定吸光度，对照标准曲线计算大蒜素含量。

大蒜经破碎，蒜酶活化，催化蒜氨形成大蒜素，大蒜素进一步分解成具有强烈臭味的硫化物[13]，正是这些硫化物使大蒜具有抗菌消炎、抗癌、治疗和预防心血管疾病、提高体细胞的免疫功能和保护肝脏[14-16]、抑制病菌的生长和繁殖作用[17-18]等功效，且使病菌不易产生抗药性。大蒜素在农业上作为杀虫剂、杀菌剂，效果显著，是一种天然的植保剂，也用于食品[19]、饲料[20-22]、医药上，大蒜素使用后在植物中的残留量远低于人体每日从大蒜中摄取的量，因此可将其用于农药、水果和食品保鲜，其作用强度相当于甚至强于苯甲酸和山梨酸等化学防腐剂[23]，目前经常使用的水果保鲜剂有用于柑橘类保鲜的碳酸氢钠、用于梨类水果保鲜的虎皮灵和用于苹果类保鲜的甲基托布津等[24]。闵玉涛等[25]、曹薇[26]、张黎明等[27]也研究了大蒜素在水果保鲜方面的应用，试验结果显示大蒜素对于水果保鲜确实有很好的效果。本研究拟研究大蒜素的提取工艺以及保鲜效果。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 试验仪器

FA1204B电子天平；恒温水浴锅（北京中兴伟业仪器有限公司）；TU-1901双光束紫外可见分光光度计（北京普析通用有限责任公司）；BK-600D超声波清洗机（济南欧莱博科学仪器有限公司）；TDZ5-WS离心机（长沙湘锐离心机有限公司）；FTIR-650傅里叶变换红外光谱仪（天津港东科技发展股份有限公司）；R-215型旋转蒸发仪（瑞士Buchi公司）。

1.1.2 试验原料与试剂

大蒜（购于天津王顶堤市场）；无水乙醇（天津市津东天正精细化学试剂厂分析纯）；标准大蒜素（上海源叶生物科技有限公司UV≥98%）。

1.2 大蒜素提取过程

本试验利用有机溶剂提取法提取大蒜素，有机溶剂选用 85%的乙醇溶液。先将新鲜大蒜捣碎成泥状，称取5 g左右的蒜泥于锥形瓶中。将锥形瓶置于水浴锅中，水浴后加入乙醇溶液进行超声，超声后在3 000 r/min条件下离心15 min，将上清液置于烧杯中。取1 mL上清液于比色管中定容后再取稀释后的溶液1 mL于比色管中定容，进行两次稀释后在最大吸收波长处测定大蒜提取液的吸光度。记录各个条件下的吸光度。

1.3 大蒜素最大吸收波长的确定

将大蒜素标准品溶解在 85%乙醇中，制成一定浓度的大蒜素标准溶液，利用TU-1901双光束紫外可见分光光度计得到紫外全波长扫描图。通过大蒜素标准品紫外谱图得到大蒜素紫外最大吸收波长，同时对比两个紫外谱图。

1.4 正交试验

提取温度、提取时间、料液比、超声温度以及超声时间对于大蒜素的提取率都有影响，料液比在 1∶5、1∶6[8，28-29]，提取的适宜温度在 40～45 ℃，时间在 60～70 min 范围内[8，12，30]，超声的温度在 35～45 ℃，时间在 50～60 min[12，28，30-31]，因此选用五因素四水平制定正交表格（表1）进行正交试验。并依据正交试验结果进一步确定大蒜素提取的最适宜条件。

表1 正交试验影响因素水平表

1.5 依据红外光谱确定大蒜素结构

在45 ℃提取50 min，加入30 mL 85%乙醇混合均匀后在600 W，45 ℃条件下超声50 min得到大蒜提取液，将提取液在R-215型旋转蒸发仪上旋转蒸发，得到淡黄色油状液体，利用FTIR-650傅里叶变换红外光谱仪对大蒜提取液进行红外测定，利用液膜法，取1～2滴大蒜提取液置于两个圆形盐片中间，形成一层液膜，放入光路检测，得到大蒜提取液红外谱图。将20 mg大蒜素标准品溶于100 mL的容量瓶中制成0.2 mg/mL的大蒜素标准溶液，与大蒜提取液同样的方法，利用红外测定大蒜素标准品的红外谱图。对比大蒜素标准品红外谱图和红外谱图确定大蒜提取液的官能团。

1.6 室温下大蒜素保存时间试验

将大蒜样品在 45 ℃水浴锅中水浴提取 80 min，加入25 mL 85%乙醇在40 ℃温度下超声40 min后离心，取上清液稀释后测定吸光度，将在该条件下得到的大蒜提取液再放置几天后测定吸光度计算大蒜素含量，观察在室温下大蒜素含量变化情况。

1.7 新鲜大蒜和发芽大蒜提取液中大蒜素含量对比

发芽的大蒜是将新鲜大蒜去掉外皮后在冰箱放置20 d后大蒜根部长出白芽，取一定量新鲜大蒜和发芽大蒜，分别在表2所示的条件下测定对应吸光度并计算大蒜素含量。

表2 新鲜大蒜和发芽大蒜提取液中大蒜素含量对比条件

1.8 大蒜提取液对蔬菜和水果保鲜效果试验

试验在温度为 21 ℃，相对湿度为 25%的条件下进行。设置喷洒大蒜提取液、大蒜素标准溶液、乙醇溶液以及空白对照，做6组平行试验，对新鲜的菠菜、苹果和香蕉进行保鲜试验。观察样品的情况。根据样品表面的腐坏情况判断大蒜素提取液对蔬菜和水果的保鲜效果。

2 结果与分析

2.1 大蒜素最大吸收波长

将大蒜提取液与大蒜素标准溶液全波长扫描得到的紫外光谱图进行对比如图2所示，大蒜提取液与大蒜素标准溶液均在198 nm和212 nm有吸收峰，最大吸收峰在198 nm，所以大蒜素的最大吸收波长为198 nm，两个紫外光谱图重合程度较好，吸收峰均相同。

图2 大蒜提取液与大蒜素标准溶液全波长扫描图

2.2 标准曲线绘制

在测定出大蒜提取液的吸光度后，想要确定大蒜素含量则需要绘制标准曲线。按照2.5所述的方法制备大蒜素标准溶液，分别取 0.25、0.50、1.00、1.50、2.00、2.50、3.00 mL 0.2 mg/mL 的大蒜素标准溶液置于25 mL比色管中，定容后制成0.002、0.004、0.008、0.012、0.016、0.020和0.024 mg/mL的大蒜素标准溶液，取0.25 mL 0.2 mg/mL的大蒜素标准溶液置于50 mL容量瓶中定容制成0.001 mg/mL的标准溶液。在最大吸收波长处测定各个浓度大蒜素标准溶液吸光度，绘制标准曲线，并计算出线性回归方程，系统误差为0.102，去除系统误差后线性回归方程为y＝23.946 0x＋0.057 8，R2＝0.994 2，相关性较好（图3）。

图3 大蒜素标准曲线

2.3 正交试验结果

通过进行五因素四水平的正交试验，得到各个正交条件下大蒜素的提取率，试验结果如表 3所示。

表3 正交试验结果

依据表3中K值大小可知，大蒜素提取率最高的组合是A4B3C2D1E2，即大蒜素提取的最适宜条件是提取温度50 ℃，提取时间70 min，料液比1∶5，超声温度30 ℃，超声时间50 min。且依据R值得到大蒜素提取率影响因素的影响大小是 A＞C＞E＞B＞D，即提取温度＞料液比＞超声时间＞提取时间＞超声温度。在最适宜条件下进行大蒜素提取得到吸光度为 0.416，大蒜素提取率为4.60%。

2.4 大蒜素标准品红外光谱图与大蒜提取液红外光谱图

大蒜素标准溶液的红外光谱图与大蒜提取液的红外光谱图对照如图4所示。

图4 大蒜素标准品与大蒜提取液的红外光谱对比图

大蒜素标准品的红外光谱图在 3 383 cm-1有吸收峰，由于大蒜素由乙醇溶液溶解，所以推测是乙醇或水的羟基吸收峰，在2 974 cm-1的吸收峰推测为末端双键，在1 647 cm-1有吸收峰但强度比C＝＝O双键的弱一些，推测为硫氧双键，1 381 cm-1位于指纹区，推测为S＝＝O的伸缩振动吸收峰，1 087 cm-1和1 049 cm-1为S-S的吸收峰，879 cm-1为亚甲基的 C-H吸收峰，与大蒜素的结构式基本符合。大蒜提取液的红外谱图在3 342 cm-1有一个宽的吸收峰，推测为乙醇或水的羟基吸收峰，2 931 cm-1的吸收峰推测为末端双键，1 622 cm-1的吸收峰的强度没有C＝＝O的吸收峰强度强，故推测为S＝＝O的吸收峰，1 406 cm-1位于指纹区，推测为S＝＝O的伸缩振动吸收峰，1 128 cm-1和1 026 cm-1有相邻的2个吸收峰，推测为S-S的伸缩振动吸收峰，931 cm-1推测为亚甲基的C-H吸收峰。如图4所示，大蒜提取液的红外谱图与大蒜素标准品的红外谱图各个吸收峰的重合程度高，并且与大蒜素的结构式符合。结合大蒜素标准品和大蒜提取液的紫外谱图对比从而可以确定提取的物质为大蒜素，并且提取液的红外谱图的峰较清晰，且杂峰不多，说明提取的大蒜素中杂质含量较少。

2.5 室温下大蒜素保存时间试验

记录室温下放置的大蒜提取液的吸光度，依据标准曲线计算出大蒜素含量如表4所示，发现大蒜素含量随着放置时间的增加逐渐减少，第 8天大蒜素含量仅剩 0.26%。说明大蒜素易挥发，在室温下保存时间不长，第8天大蒜素含量已经很少了。

表4 室温下保存时间试验结果

2.6 新鲜和发芽大蒜提取液中大蒜素含量对比

根据表2设计的试验得到结果如表5所示，发芽大蒜里的大蒜素含量较新鲜大蒜里的大蒜素含量稍多，由于发芽大蒜中含有较多的抗氧化性的硒元素，可以减少自由基破坏，但发芽对于大蒜中大蒜素含量影响不大，最大相差 0.26%。发芽后大蒜内的其他物质含量有待进一步测定。

表5 新鲜大蒜和发芽大蒜提取液中大蒜素含量对比 %

2.7 果蔬保鲜试验

按照 2.8的试验过程进行蔬菜和水果保鲜试验，如图5所示，在菠菜试验中，与第0天的新鲜菠菜相比，第4天空白对照有很明显的缩水现象，而其他对照组的缩水现象不明显，形状几乎没变，喷洒乙醇溶液的菠菜变黄并且比喷洒大蒜提取液和大蒜素标准液的黄一些，大蒜素标准液的变黄程度更小一些。另外在喷洒乙醇溶液、大蒜提取液、大蒜素标准溶液的菠菜中出现褪色现象，而在空白对照中并没有出现，推测为乙醇溶液可以提取菠菜中的色素，如图 6所示。到第 9天时，6组均已经呈现完全风干状态，且空白对照组中的菠菜叶已经明显缩皱，而其他各组大部分叶片大小形状均保持较好。

图5 菠菜保鲜试验各个对照组结果对比图

图6 菠菜保鲜试验中特殊脱色现象结果对比图

如图7所示，在苹果的抗氧化试验中，在30 min后，空白对照和喷洒乙醇溶液的苹果表面有很明显的氧化现象，喷洒大蒜提取液和大蒜素标准溶液的苹果表面氧化现象不明显，60 min后，各个对照组都有不同程度的氧化现象，氧化程度由大到小为：对照组，喷洒乙醇溶液组＞喷洒大蒜提取液组＞大蒜素纯品溶液组。如图8所示，在苹果的表皮保鲜试验中，到第4天，空白对照的苹果表面有明显缩水现象，喷洒乙醇溶液的苹果有部分缩水现象，其他两组的缩水现象不明显，喷洒大蒜提取液和喷洒大蒜素标准溶液的苹果表面形成一层黏膜，减少水分流失以及与空气的接触，使得喷洒大蒜提取液和大蒜素标准溶液的苹果缩水现象不明显，比喷洒乙醇溶液和空白对照的保鲜效果好。

图7 苹果抗氧化试验各个对照组结果对比图

图8 苹果表皮保鲜试验各个对照组结果对比图

在香蕉保鲜试验中，如图9所示，第4天时表皮有些许变黑，第9天时香蕉表皮已经大面积变黑，但是喷洒有大蒜提取液和大蒜素标准溶液的香蕉表皮变黑面积较其他两组对照少，第9天香蕉的内部图看出空白对照组有5组已经坏掉，呈现发黄并且黏手的状态，其中第1组已腐坏到不成型，喷洒乙醇溶液的对照组有4组呈现发黄并且黏手的状态，其中第5组和第6组的香蕉头部有明显变黑现象，喷洒大蒜提取液的对照组有2组是呈现发黄并且黏手的状态，并且没有其他组的那么严重，喷洒大蒜素标准溶液的对照组有 3组是呈现发黄并且黏手的状态，其中第2组彻底坏掉，形状软榻。从以上水果试验结果可以看出，大蒜素对于水果有很好的保鲜效果，并且在放置几天后大蒜的味道仍有残留，说明大蒜素并未完全挥发。大蒜素标准溶液和大蒜提取液的效果不能很好的区分可能是由于浓度的差异，后续可以进行不同浓度大蒜素对于水果保鲜的效果试验。

图9 香蕉保鲜试验各个对照组结果对比图

3 结论

大蒜素紫外最大吸收波长为198 nm。大蒜素标准溶液的浓度与吸光度有良好的线性关系，试验结果较准确，可用于测定大蒜素提取液中大蒜素含量。通过正交试验的方法对大蒜提取液进行吸光度的测定和数据分析，得到大蒜素提取的最适宜提取条件是提取温度为 50 ℃，提取时间为70 min，料液比1∶5，超声温度为30 ℃，超声时间为50 min。在最适宜条件下进行大蒜素提取得到吸光度为0.416，大蒜素提取率为4.60%。大蒜素提取率影响因素的影响大小为提取温度＞料液比＞超声时间＞提取时间＞超声温度。通过菠菜、苹果和香蕉的保鲜试验，得到大蒜素对蔬菜和水果有很好的保鲜和抗氧化效果。

4 展望

本研究初步对蔬菜水果进行保鲜和抗氧化试验研究，由于大蒜便宜易得，且大蒜素对人体有较多益处，所以将大蒜素用于蔬菜水果保鲜有很大的应用前景。提取得到的大蒜素是油状液体，提纯时在进行旋转蒸发后，液体会黏在烧瓶的瓶壁上，造成误差较大，纯度测定结果不可靠，所以本试验未进行纯度测定，在后续大蒜素的研究中大蒜素的提纯是很好的研究方向。