产朊假丝酵母富硒条件的优化及发酵罐培养

马楚楚，陈帅君，赵宝顶，唐伦霞，童应凯，边嘉宾

（天津农学院 农学与资源环境学院，天津 300392）

硒元素是1817年由ALLAN等[1]首次发现，在之后的几十年里，硒被认为是一种有毒的重金属物质，高剂量的硒对生物体有较大的毒性和致癌性[2]。但在1949年，CLAYTON等[3]研究发现，摄入适量的硒能够减少肿瘤的发生率。1957年，SCHWARZ等[4]通过大鼠试验证明在食物中加入适量的硒能够阻止肝脏坏死。1973年，TURNER等[5]证实硒元素是组成甘氨酸还原酶系统的必需元素。1976年，对该酶硒蛋白组分的化学特征进行研究，证实了有机硒组分为硒代半胱氨酸[6]。

缺硒会引发许多疾病，如抑郁症、心血管疾病、肿瘤、甲状腺功能紊乱、病毒性疾病（如流行性感冒，HIV，埃博拉），精子活性低等[7-9]。补充适量的硒可有效预防此类疾病的发生。1988年，我国把硒元素列为食物中必需的营养元素之一[10]。当今富硒产品主要有富硒植物、富硒鸡蛋、富硒牛奶和富硒酵母，其中最常见的市售硒源是富硒酵母[11]。

产朊假丝酵母（Candida utilis）可以产生大量单细胞蛋白，作为美国食品药品监督管理局评价食品添加剂安全性指标（Generally regarded as safe，GRAS）微生物，具有十分广阔的应用前景[12]。本研究以产朊假丝酵母为出发菌株，向酵母培养液中加入一定量的Na2SeO3，通过酵母的生物转化作用，把无机硒转变为有机硒[13]，以获得富硒产朊假丝酵母，将其制备成饲料添加剂饲喂家畜家禽，从而获得富硒农产品。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 菌种

产朊假丝酵母（C. utilis），保藏于天津农学院生物技术系微生物菌种保藏中心。

1.1.2 培养基

斜面培养基：葡萄糖20.0 g/L，蛋白胨 10.0 g/L，酵母膏 10.0 g/L，琼脂20.0 g/L，pH 6.0。

种子培养基：葡萄糖 20.0 g/L，蛋白胨 10.0 g/L，酵母膏 10.0 g/L，pH 6.0。

发酵培养基：葡萄糖30.0 g/L，硫酸铵8.0 g/L，磷酸二氢钾3.0 g/L，硫酸镁0.25 g/L，pH 6.0。

补料培养基：葡萄糖150 g/L，硫酸铵18 g/L，磷酸二氢钾6.75 g/L，硫酸镁1.125 g/L（灭菌时，葡萄糖与其他成分分开灭菌）。

1.1.3 仪器设备

可见分光光度计（UNIC-UV2100）、电热恒温培养箱（DHP-9052B，上海一恒科学仪器有限公司）、立式压力蒸汽灭菌锅（LDZX-30FBS，上海申安医疗器械厂）、电子天平（ACR120，梅特勒-托利多仪器）、摇床（HNY-2112F，天津欧诺仪器股份有限公司）、电热鼓风干燥箱（DHG-9140A，上海一恒科学仪器有限公司）、离心机（LXJ-IIB，飞鸽牌）、数显恒温水浴锅（HH-4，瑞华仪器制造有限公司）。

1.1.4 药品

亚硒酸钠、硫酸镁、亚硒酸、盐酸苯肼、变色酸、3，5-二硝基水杨酸，成都艾科科技有限公司；EDTA二钠、氯酸钾、高氯酸、浓盐酸、浓硝酸、葡萄糖、重苯酚、亚硫酸钠、硫酸氢二钾，国药集团化学试剂有限工商网；酵母浸出膏、蛋白胨、氢氧化钠、酒石酸钾钠，北京奥博星生物技术有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 菌株生长曲线的绘制

将石蜡管封存的菌种接种在斜面培养基中，培养12 h后挑取一环接于种子培养基中，培养18 h后按8%接种量接种于发酵培养基中，然后每2 h取样1次，样品稀释10倍，测定在600 nm处的吸光度，绘制标准曲线。

1.2.2 硒质量浓度对酵母富集有机硒的影响

设置初始硒质量浓度为0，5，10，15，20，25，30 μg/mL，装液量为40 mL/250mL广口三角瓶（下同），初始pH 6.0，培养时间35 h，温度29 ℃，转速200 r/min。在发酵对数期后期（12 h）向培养基中添加Na2SeO3[14]，发酵至35 h时，取出发酵液，离心洗涤3次，测定生物量和硒含量。

1.2.3 硒添加方式对酵母富集有机硒的影响

设置5组试验方案：①在12 h一次性添加10 μg/mL Na2SeO3；②分别在12 h 和 16 h 添加5 μg/mL Na2SeO3；③在 12 h 一次性添加 15 μg/mL Na2SeO3；④分别在12 h和16 h添加5 μg/mL和10 μg/mL Na2SeO3；⑤分别在12 h和16 h添加10 μg/mL和5 μg/mL Na2SeO3。发酵条件按照1.2.2试验中最优方案操作。

1.2.4 初始pH对酵母富集有机硒的影响

调节发酵培养基初始pH分别为4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0，发酵条件按照1.2.3试验中最优方案操作，发酵完毕后测定生物量和硒含量。

1.2.5 摇瓶装液量对酵母富集有机硒的影响

设置装液量分别为30、35、40、45、50、55、60 mL 7个梯度，试验方案按照1.2.4试验中最优方案操作，发酵完毕后测定生物量和硒含量。

1.2.6 正交试验

根据上述单因素试验，选择硒质量浓度（μg/mL），接种量（%），培养基初始 pH，装液量（mL）4个因素，制定3个水平，进行L9（34）正交试验，正交试验表如表1所示。

表1 正交试验实施表

1.2.7 发酵罐分批培养

试管斜面活化12 h后接种于种子培养基中培养18 h，然后按10%接种量接于发酵罐中，装液量为4 L/7 L发酵罐，温度为29 ℃，通过自动流加3 mol/L H2SO4或3 mol/L NaOH进行调节，pH恒定为5.5，初始搅拌转速为300 r/min，溶氧控制在30%，接种0.5 h后与转速偶联。每2 h取一次样，测定糖含量和生物量。

1.2.8 发酵罐分批补料培养

前期同分批培养，在葡萄糖消耗完后以 100 mL/h流加补料培养基补料10 h。每2 h取样一次，测定生物量和残糖量。

1.2.9 发酵罐分批补料加硒试验

培养条件与方法同分批补料培养，在26 h和37 h 分别加入 Na2SeO320 μg/mL 和 10 μg/mL，测定硒含量。

1.3 指标分析方法

1.3.1 酵母生物量（DCW）的测定[14]

取30 mL发酵液于50 mL离心管中，3 000 r/min离心10 min，蒸馏水离心漩涡震荡洗涤3次，将得到的湿菌体于80 ℃烘箱中烘干至恒重，计算酵母细胞干重。

1.3.2 葡萄糖浓度的测定

采用3，5-二硝基水杨酸法[15]。

1.3.3 硒含量的测定

采用催化分光光度法[16]。

发酵液中总有机硒含量（μg/L）＝菌体有机硒（μg/g）×DCW（g/L）

发酵液中有机硒得率/%＝发酵液中总有机硒含量（μg/L）/初始添加的无机硒质量浓度（μg/L）

2 结果与分析

2.1 菌株生长曲线

研究表明，酵母细胞在对数期吸收硒的能力最高[17]。由菌株生长曲线可知，酵母在培养 12 h时开始由对数期进入稳定期（图1）。因此选择在培养时间12 h时加入无机硒Na2SeO3。

图1 菌体生长曲线

2.2 硒质量浓度对酵母富集有机硒的影响

由图2可知，在硒质量浓度0～30 μg/mL范围内，随着硒质量浓度的增加，酵母生物量逐渐下降，由9.893 g/L下降至3.908 g/L，可见无机硒对酵母的生长具有抑制作用，且质量浓度越大，这种抑制作用越强。在硒质量浓度为25 μg/mL和30 μg/mL时，发酵液颜色略显红色，这是由于处于较高的质量浓度时，无机硒被还原为单质硒，致使发酵液颜色呈红色。在硒质量浓度为20 μg/mL时，总有机硒含量最高，达到9 954.4 μg/L，但有机硒得率（49.77%）和生物量（4.75 g/L）普遍比硒质量浓度为15 μg/mL（有机硒得率56.8%，生物量5.84 g/L）时偏低。由于所获得的产品为菌液，在获得有机硒越来越多的同时，应保证菌液中无机硒不能增长过快，否则对饲养动物有较大毒害作用。因此，选择15 μg/mL为最适硒添加质量浓度。

图2 硒质量浓度对酵母富集有机硒的影响

2.3 硒添加方式对酵母富集有机硒影响

由图3可知，从发酵液中总有机硒含量、DCW两个指标来看，在培养12 h一次性加入无机硒15 μg/mL时，两个指标在5组数据中均最高。因此，在后续试验中，选择培养12 h时一次性加入无机硒 15 μg/mL。

图3 硒添加方式对酵母富集有机硒的影响

2.4 初始pH对酵母富集有机硒的影响

pH对酵母细胞膜的透性有重要影响，从而影响酵母对硒元素的生物转化。由图4所示，初始pH对酵母生物量及硒富集量均有一定的影响。pH过低或过高都会抑制酵母的生长和对硒的吸收，当培养基初始pH值为6.0时，发酵液中总有机硒含量最高。因此，后续试验中培养基适宜的初始pH为6.0。

图4 初始pH对酵母富集有机硒的影响

2.5 摇瓶装液量对酵母富集有机硒的影响

由图5可知，摇瓶装液量越多，越有利于菌株对硒的富集，但得到的生物量较少，而摇瓶装液量越少，菌体对硒的富集量越少，但有较高的生物量。根据发酵液中总有机硒曲线，可知当装液量为40 mL时，其发酵液中总有机硒含量较高，达到 9 821.75 μg/L。因此，选择最适装液量为40 mL。

图5 摇瓶装液量对酵母富集有机硒的影响

2.6 正交试验结果分析

张帆等[18]研究表明，在单因素试验基础上，Na2SeO3质量浓度、初始pH和培养温度对产朊假丝酵母富硒工艺的影响较大，本试验选取这3个因素对提取工艺进行优化。由表2可见，在发酵液中总有机硒和菌体有机硒的影响因素方面，各因素所占比重有所不同，5号试验组的发酵液中总有机硒含量最高，达到9 792.732 μg/L，8号试验组的菌体有机硒含量最高，为2 643.071 μg/g。以发酵液中总有机硒含量为分析对象，各因素的比重大小依次为：硒质量浓度＞接种量＞装液量＞初始pH。以发酵液中总有机硒含量来看，5号试验组最好，可以达到菌体有机硒含量和生物量之间的平衡，即：硒质量浓度15 μg/mL、接种量8%、初始pH 6.5、装液量为35 mL。此时发酵液中的总有机硒含量为9 792.732 μg/L，菌体有机硒含量为1 400.362 μg/g。

表2 正交试验结果分析表

以菌体有机硒为分析对象，各因素的比重大小依次为：硒质量浓度＞初始pH＞装液量＞接种量，并且硒质量浓度是两个指标的最重要影响因素。这是因为硒质量浓度越大，对生物量产生的抑制作用越大，造成生物量减少，虽然单位菌体有机硒含量高，但生物量较少，导致发酵液中总有机硒含量也不是很高[19]。

2.7 分批培养结果分析

由图 6可知，产朊假丝酵母开始发酵在第 6小时进入对数期，葡萄糖消耗明显加快，直到发酵12 h时糖量基本耗尽，在18 h后生物量趋于稳定，并在24 h时达到最大，为13.07 g/L。因此，在分批补料培养时，在12 h左右开始补料为宜。

图6 分批培养生物量和残糖量

2.8 分批补料培养结果分析

补料分批培养比分批培养具有明显的优势[20]，这种培养方式解除了底物抑制、产物反馈抑制和葡萄糖分解阻遏效应，从而提高了产率。由图 7可知，葡萄糖在11 h时基本耗尽，此时开始补料。在开始补料前6小时残糖量处于较低水平，但在后4小时残糖量上升较快，并在停止补料后残糖量缓慢下降。初步分析在补料前6小时酵母迅速繁殖，对发酵液中的溶解氧要求越来越多，而在补料后期发酵罐中溶解氧满足不了菌量的需求，补料时溶解氧降至0，酵母细胞在缺氧条件下，菌体进行无氧呼吸，葡萄糖利用率下降，不再进行繁殖，这可能也是在补料后期残糖量上升的原因之一，此时很难获得较高的生物量[21]。发酵罐供氧不足也是影响酵母高密度培养的一个重要因素。在后续试验中，可以利用纯氧来缓解供氧的不足。

图7 分批补料培养生物量和残糖量

2.9 分批补料加硒试验结果分析

由表3可知，随着培养时间的延长，36 h和48 h时总有机硒含量和有机硒得率均比30 h和42 h高，在48 h时发酵液中总有机硒含量为10 089.00 μg/L。

表3 分批补料加硒试验结果分析表

3 结论

本文以产朊假丝酵母为研究对象，将无机硒转化为有机硒，研究硒质量浓度、硒添加方式、初始pH、摇瓶装液量对酵母富集硒的影响，以这些单因素的试验结果来分析设计L9（34）正交表以进一步优化培养条件，获得发酵液中总有机硒含量最高时的培养条件，即：硒质量浓度15 μg/mL、接种量8%、初始pH 6.5、装液量为35 mL，此时总有机硒含量为9 792.732 μg/L，相比于邹艳等[22]的总有机硒含量为8 790 μg/L有所提高。菌体有机硒最高时的条件为：硒质量浓度20 μg/mL、接种量8%、初始pH 5.5、装液量45 mL，菌体有机硒含量为2 750.41 μg/g，此时生物量为3.1 g/L。本研究在发酵罐分批培养过程中也获得比较满意的结果，但在获得高浓度菌体方面还有待于进一步研究优化。