lncRNA MEG3对胃癌细胞侵袭、转移及miR-373-5p/BTG3轴的影响

胡广军，宗殿亮，孙清森，赵俊卿，张新如，谷 斌

(沧州市人民医院胃肠外科,沧州 061000；*通讯作者,E-mail:huguangjun666@163.com)

胃癌(gastric cancer, GC)是全球常见消化系统恶性肿瘤，在全球发病率排列第四位，死亡率排列第二[1]。胃癌与大多数肿瘤疾病相似，早期无明显临床症状，确诊时多数为中晚期，肿瘤细胞侵袭及转移能力较强，可直接侵入血管而引起远处转移，导致患者预后较差[2]。近些年，随着分子生物技术的发展，发现长链非编码RNA(long non-coding RNA，lncRNA)及微小RNA(miRNA)与多种恶性肿瘤疾病发生发展关系密切。母系表达基因3(materally expressed gene 3, MEG3)属于lncRNA家族成员之一，是首个具有肿瘤抑制作用的长链RNA，在胃癌组织中显著低于癌旁组织[3]。lncRNA MEG3在胃癌组织表达降低，随着肿瘤体积增加及TNM分期升高而降低，并认为转染类似物或抑制物对胃癌细胞增殖及凋亡具有调控作用。微小RNA(miRNA)是由多个核苷酸组成小分子RNA，可进行基因转录、DNA复制等作用，miR-373最初在人类胚胎干细胞中发现的一种特异性RNA，在睾丸生殖细胞癌细胞中miR-373具有致癌作用[4]。研究发现，胃癌中miR-373-5p表达升高，通过转染抑制物降低表达后可减少胃癌细胞增殖，对控制胃癌疾病发展具有重要作用。miR-373-5p可以受到lncRNA调节在恶性肿瘤中发挥作用。例如在宫颈癌细胞中，上调lncRNA SATB2-AS1的表达水平可通过调控miR-373-5p/BTG3轴参与宫颈癌的进展，抑制癌细胞增殖并诱导细胞凋亡。在胃癌中B细胞易感基因3(B-cell translocation gene 3,BTG3)被作为抑癌基因，可以抑制胃癌细胞增殖且促进凋亡[5]。但是关于lncRNA MEG3在胃癌细胞中对miR-373-5p/BTG3活性的影响还不明确。本文通过观察lncRNA MEG3靶向miR-373-5p/BTG3轴对胃癌细胞侵袭及转移的影响，有望为相关研究提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 细胞来源及培养

正常胃上皮细胞GES-1，胃癌细胞SGC-7901细胞均购自美国菌种保存中心(ATCC)。细胞培养所有的培养基为RPMI1640，在培养基中加入7%的胎牛血清、100 μg/ml的链霉素、100 IU/ml的青霉素，细胞在37 ℃、CO2的细胞培养箱中培养。间隔48 h，当细胞生长密度为90%时可进行传代，取对数细胞进行实验。

1.2 主要试剂及仪器

lncRNA MEG3、miR-373-5p引物均购自上海吉凯制药有限公司；Lipofectamine2000转染试剂购自重庆市华雅干细胞技术有限公司；DMEM培养基购自上海微科生物技术有限公司；牛血清、0.25%胰蛋白酶均购自上海素尔生物科技有限公司；鼠抗人BTG3单克隆抗体购自上海圻明生物科技有限公司；山羊抗兔IgG购自武汉纯度生物科技有限公司；Cell Counting Kit-8(CCK-8)试剂盒购自弗元(上海)生物科技有限公司；流式细胞仪购自美国贝克曼库尔特公司；荧光素酶报告基因质粒购自翌圣生物科技(上海)股份有限公司；逆转录试剂盒及PCR试剂盒购自江西江蓝纯生物有限公司；实时荧光定量PCR仪购自中山大学达安基因股份有限公司。

1.3 分组及细胞转染

SGC-7901细胞株分为：空白组(无转染)、空载组(转染空质粒pcDNA)、MEG3组(转染pcDNA-MEG3)。PBS缓冲液将胃癌细胞株洗净，重复3次，胰蛋白酶消化2 min，离心15 min后，将数目为5×103细胞平铺到6孔板中，融合率达到70%，采用无血清培养基按照3 μl稀释，在37 ℃下孵育20 min，转染按照Lipofectamine 2000说明书操作，分别将pcDNA-MEG3、pcDNA转染到细胞株中，37.5 ℃，5%CO2继续培养。12 h后将无血清培养基更换为完全培养基，继续培养24 h后，提取细胞RNA，采用qRT-PCR法验证转染效率。

1.4 qRT-PCR检测正常胃上皮细胞及胃癌细胞中MEG3、miR-373-5p、BTG3mRNA表达

正常胃上皮细胞GES-1及胃癌SGC-7901细胞移入离心管中，加入100 μl的总RNA抽提试剂Trizol，进行摇晃，加入40 μl的氯仿，持续震动10 s。静置5～10 min，低温3 500 r/min，离心15 min，样品出现明显分离层，将上层RNA进行吸取，加入离心管中冷却后再次加入氯仿，摇匀后孵育10 min，然后按照3 500 r/min，再次离心15 min后，保留下方沉淀物，加入2 ml的乙醇，对沉淀物进行洗涤。保留下方沉淀，干燥，加入15 μl的超纯水，待RNA完全水解后，75 ℃保温20 min，采用分光光度计检测RNA的紫外吸收值比值。反应条件：①第1阶段：预变性(95 ℃ 30 s)；②第2阶段：PCR反应(95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s)40个循环；③第3阶段：溶解曲线分析获得的cDNA，反应条件为95 ℃反应15 s，60 ℃反应60 s，95 ℃再次反应15 s，将提取的RNA进行转录为cDNA，获得反应体系，条件为：42 ℃反应时间60 min，72 ℃反应时间5 min，4 ℃终点。将每组细胞设置复孔3个，以U6为内参，反应条件为95 ℃预反应3 min，95 ℃反应5 s，58 ℃退火，整个实验做40个循环，检测结果采用2-ΔΔCt方法进行分析，引物序列见表1。

表1 基因引物序列Table 1 Gene primer sequences

1.5 Transwell小室检测细胞侵袭能力

将各组SGC-7901细胞调整密度为1×108/L，用DMEM稀释到0.25 μg/μl工作液放置冰盒中，将100 μl基底膜基质平铺在24孔小室内，37 ℃，5%CO2培养箱中孵育，使基底膜基质凝固，上室中加入100 μl细胞培养液，下室中加入少量胎牛血清培养基，37 ℃培养箱中培养24 h，取出小室，拭去残留细胞，冲洗，染色。计算SGC-7901细胞侵袭细胞数，实验3次，复孔2次。

1.6 细胞划痕实验检测细胞迁移距离

将各组SGC-7901细胞常规消化离心，每孔5×103细胞，均匀接种到6孔培养板内，每孔加入1 ml细胞悬液，待细胞铺满整个孔底部后，用1 ml枪头缓慢竖直划出一条笔直划痕，放弃去培养液，PBS冲洗2次，吸取残留细胞，每孔内加入含有1 mg/L丝裂霉素的PBS 200 μl，37 ℃孵育1 h。固定染色，超纯水清洗2次，倒置显微镜拍照观察并计算划痕区的细胞数，实验3次，复孔2次。

1.7 免疫荧光检测各组SGC-7901细胞BTG3表达

将各组SGC-7901细胞消化后接种于6孔板中，培养24 h加入多聚甲醛(4%)固定，15 min后PBS冲洗加入0.1%聚乙二醇辛基苯基醚透明15 min，PBS冲洗，采用5%的牛血清白蛋白(BSA)封闭液封闭30 min，加入BTG3(1 ∶500)一抗，室温孵育2 h，加入荧光标记的二抗(1 ∶2 000)避光作用1 h，采用DAPI细胞核染色在聚焦显微镜观察并拍照。

1.8 双荧光素酶报告基因验证MEG3对miR-373-5p调控作用

将SGC-7901细胞接种于6孔板中，按照LipofectamineTM2000说明将miR-373-5p-3′-UTR-WT、miR-373-5p-3′-UTR-MUT、BTG3-3′-UTR-WT、BTG3-3′-UTR-MUT质粒转染空载组及MEG3组，按照说明书，使用双荧光素酶报告系统试剂盒测量MEG3对miR-373-5p及BTG3的表达活性的调控能力。

1.9 统计学分析

2 结果

2.1 正常胃上皮细胞GES-1和SGC-7901细胞中MEG3、miR-373-5p、BTG3 mRNA表达

正常胃上皮细胞GES-1及SGC-7901细胞的MEG3 mRNA表达量分别为1.00±0.00和0.18±0.04，差异有统计学意义(t=50.210，P<0.05)；miR-373-5p mRNA表达量分别为1.00±0.00和1.63±0.20，差异有统计学意义(t=7.716，P<0.05)；BTG3mRNA表达量分别为1.00±0.00和0.38±0.09，差异有统计学意义(t=16.870，P<0.05，见图1)。

与GES-1相比，*P<0.05图1 正常胃上皮细胞GES-1和SGC-7901细胞中MEG3 mRNA表达Figure 1 MEG3 mRNA level in GES-1 and SGC-7901

2.2 各组SGC-7901细胞中MEG3 mRNA表达

空白组和空载组MEG3 mRNA表达比较差异无统计学意义(t=1.960，P=0.078)，MEG3组MEG3 mRNA表达分别高于空白组和空载组(t空白组vs MEG3组=16.530，P<0.001；t空载组vs MEG3组=14.510，P<0.001，见图2)。

与空白组相比，***P<0.001；与空载组相比，###P<0.001图2 各组SGC-7901细胞中MEG3 mRNA表达Figure 2 MEG3 mRNA expression in SGC-7901 cells

2.3 各组SGC-7901细胞侵袭数目比较

空白组、空载组及MEG3组细胞中侵袭数目分别为(92.50±10.33)个、(89.69±12.50)个及(49.63±4.56)个，差异有统计学意义(F=36.480，P<0.001)。进一步两两比较，空白组和空载组差异无统计学意义(t=0.425，P=0.680)，MEG3组与空白组、空载组比较差异有统计学意义(t空白组vs MEG3组=7.375，P=0.001；t空载组vs MEG3组=9.300，P=0.001，见图3)。

图3 各组SGC-7901细胞侵袭数目比较 (×200)Figure 3 Comparison of SGC-7901 cell invasion numbers among groups (×200)

2.4 各组SGC-7901细胞迁移比较

空白组、空载组及MEG3组细胞中划痕愈合率分别为(84.10±5.61)%,(83.05±6.16)%及(48.33±5.04)%，差异有统计学意义(F=78.660，P<0.001)。进一步两两比较，空白组和空载组细胞划痕愈合率比较差异无统计学意义(t=0.309，P=0.764)，与空白组和空载组比较，MEG3组细胞划痕愈合能力减弱，细胞划痕愈合率降低，差异有统计学意义(t空白组 vs MEG3组=11.620，P=0.001；t空载组 vs MEG3组=10.690，P=0.001，见图4)。

图4 各组SGC-7901细胞迁移比较 (×200)Figure 4 Comparison of SGC-7901 cell migration among groups (×200)

2.5 各组SGC-7901细胞中BTG3蛋白水平比较

DAPI呈现蓝色、BTG3为绿色，两个叠加呈蓝色绿色双染，空白组和空载组BTG3荧光强度相似，与空白组和空载组相比，MEG3组BTG3荧光强度增加。空白组、空载组及MEG3组胃癌细胞中BTG3蛋白水平分别为0.54±0.04，0.57±0.03及1.12±0.08，差异有统计学意义(F=224.200，P<0.001)。进一步两两比较，空白组和空载组BTG3蛋白水平比较差异无统计学意义(t=1.470，P=0.172)，与空白组和空载组比较，MEG3组BTG3蛋白水平升高，差异有统计学意义(t空白组 vs MEG3组=15.88，P<0.001；t空载组 vs MEG3组=15.770，P<0.001，见图5)。

图5 各组SGC-7901细胞中BTG3蛋白水平比较Figure 5 BTG3 protein levels in SGC-7901 cells in each group

2.6 各组SGC-7901细胞中miR-373-5p和BTG3 mRNA水平比较

空白组和空载体组SGC-7901细胞中miR-373-5p、BTG3 mRNA水平比较差异均无统计学意义(P>0.05)；与空载体组相比，MEG3组SGC-7901细胞中miR-373-5p mRNA水平降低、BTG3 mRNA水平升高(均P<0.001，见表2)。

表2 各组SGC-7901细胞中miR-373-5p、BTG3 mRNA水平比较Table 2 Comparison of miR-373-5p and BTG3 mRNA levels in SGC-7901 cells between groups

2.7 MEG3、miR-373-5p、BTG3 mRNA相关性分析

胃癌SGC-7901细胞中MEG3与miR-373-5p呈现负相关性(r=-0.336，P<0.001)，胃癌SGC-7901细胞中MEG3与BTG3呈现正相关性(r=0.413，P<0.001)，胃癌SGC-7901细胞中miR-373-5p与BTG3呈现负相关性(r=-0.400，P<0.001，见图6)。

图6 MEG3、miR-373-5p、BTG3 mRNA相关性分析Figure 6 Correlation between MEG3, miR-373-5pand BTG3 mRNA

2.8 荧光素酶验证MEG3对miR-373-5p、BTG3靶向作用

观察上调lncRNA MEG3对miR-373-5p、BTG3的荧光活性变化，结果发现，与空载组相比，MEG3组的miR-373-5p-3′-UTR-WT水平降低，BTG3-3′-UTR-WT水平升高(P<0.05，见图7，8)。

图7 MEG3对miR-373-5p、BTG3靶向作用Figure 7 MEG3 targeting miR-373-5p and BTG3

与空载组相比，#P<0.05图8 空载组及MEG3组miR-373-5p、BTG3水平比较Figure 8 Comparison of the levels of miR-373-5p and BTG3 between empty vector group and MEG3 group

3 讨论

胃癌是消化系统常见肿瘤疾病[6]。研究发现，lncRNA、miRNA在恶性肿瘤疾病具有重要作用，采用高通量测序技术鉴定出多种与胃癌相关的1ncRNAs、miRNAs，并认为其水平的改变在胃癌中可发挥致癌或抑癌作用[7]。

长链非编码RNA(long non-coding RNA, lncRNA)是长度大于200个核苷酸的非编码RNA，最初被认为是基因组转录的噪音，但后有研究证实，lncRNA在调控基因表达中具有不可或缺性[8]。lncRNA MEG3位于人类染色体14q32，MEG3在脑垂体组织中呈现高表达，当垂体癌变时其表达水平降低或缺失，认为MEG3低表达与肿瘤细胞浸润增加相关[9]。肿瘤细胞侵袭及转移均是在癌细胞增殖的基础，癌细胞游离原病灶，通过细胞外基质，游走在血液循环系统内，逃避免疫监视，发生免疫逃窜。赵力等[10]研究认为在鼻咽癌细胞中MEG3表达缺失，通过质粒转染后水平升高可减少鼻咽癌细胞侵袭及转移，研究机制可能与抑制细胞上皮细胞-间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)相关。MEG3是一种抑制胃癌细胞活性内源RNA，与miRNA存在竞争性，MEG3在miR-181位点依赖因子中可影响胃癌细胞表型，并通过改善miRNA靶向调控miR-181进而抑制胃癌细胞活性[11]。刘婵等[12]研究发现lncRNA MEG3可以通过抑制胃癌细胞中基质金属蛋白酶-2(matrix metalloproteinase-2,MMP-2)及基质金属蛋白酶-9(matrix metalloproteinase-9,MMP-9)表达而抑制肿瘤细胞侵袭及转移。郭苹等[13]研究表明，胃癌细胞中上调MEG3水平可提高顺铂化疗敏感性，研究机制与抑制STAT3磷酸化及Bcl-2表达相关。本文研究表明，上调lncRNA MEG3可显著降低胃癌细胞侵袭及转移，可能与其改善细胞EMT转化，降低细胞侵袭及转移能力，并调控Bcl-2而加快细胞凋亡。

miR-373定位于染色体19q13.42，miR-373可被核酸酶Dicer剪切成两个成熟的miR-373-3p和miR-373-5p，认为其表达与肿瘤发生发展相关。miR-373最初被认为是在胚胎干细胞中存在的特异性miRNA，在乳腺癌中可通过降低大肿瘤抑制因子2(large tumor suppressor kinase2,Lats2)表达而抑制乳腺癌细胞侵袭及迁移[14]。Looijenga等[15]研究发现，在睾丸生殖细胞癌中miR-373可以抑制p53基因通路与癌基因RAS协同作用而增加细胞生物活性。在以往的文献中发现miR-373-5p可以直接靶向沉默信息调节因子2相关酶1(silent information regulator 2 homolog 1,Sirt1)/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)信号通路而增加转录因子核因子κB(nuclear factor kappa-B，NF-κB)表达而增加肿瘤细胞侵袭及转移的能力[16]。研究表明，与正常胃组织相比，miR-373在胃腺癌组织和胃癌细胞系中表达上调。miR-373在胃癌细胞中的过表达增加了细胞增殖，miR-373的过表达导致HEK293细胞中含有TNFAIP1 3′UTR的荧光素酶报告蛋白的抑制，并降低了AGS细胞中TNFAIP1蛋白的水平，证明了miR-373的致癌作用，并通过下调TNFAIP1来控制细胞生长[17]。BTG3是B细胞迁移基因/erbB2转录因子家族成员之一，具有调控细胞生物活性及参与细胞DNA损伤修复的作用。研究发现，BTG3在胃癌组织中表达降低并与肿瘤分期及分化程度相关，随着胃癌分期增加其表达更低[18]。胃癌细胞中过表达BTG3可以抑制胃癌细胞活性，减少侵袭及迁移的同时增加肿瘤细胞凋亡[19]。本文研究结果表明，在胃癌细胞中miR-373-5p表达较高，但是转染lncRNA MEG3后的胃癌细胞中miR-373-5p表达降低，说明上调lncRNA MEG3可以抑制miR-373-5p、增加BTG3表达而减少胃癌细胞侵袭及迁移。

lncRNA MEG3在多种恶性肿瘤中已经被证实发挥抑癌作用，并通过调节miRNA或相关基因来实现的[20]。陈丹等[21]研究显示，七氟醚处理后lncRNA MEG3调控miR-222抑制胃癌细胞增殖，促进胃癌细胞凋亡。lncRNA能够作为海绵体靶点定点miRNA而参与到遗传监督过程，进一步对miRNA及下游相关基因的表达进行调控而参与细胞增殖、凋亡及侵袭。表观遗传学的监管机制放松是导致肿瘤发生发展的原因之一。在胃癌细胞中，敲降XIST可抑制AGS细胞增殖、侵袭和EMT，其作用机制是通过靶向miR-337-3p并下调HOXC8的表达[22]。另有研究表明，上调lncRNA SATB2-AS1的表达水平可通过调控miR-373-5p/BTG3轴参与CC的进展，抑制癌细胞增殖并诱导细胞凋亡[23]。本文研究结果显示：通过荧光素酶报告进一步证实，MEG3对miR-373-5p及BTG3具有靶向调控作用。lncRNA MEG3及BTG3在胃癌细胞表达降低，miR-373-5p表达升高，通过上调lncRNA MEG3表达而降低miR-373-5p表达，激活BTG3表达。生物信息学网站预测到几者之间存在相似的结合位点，而miR-373-5p能够调控癌胃癌细胞间质转化，降低其表达而抑制胃癌细胞侵袭及迁移行为。

综上所述，上调lncRNA MEG3可能靶向抑制miR-373-5p、激活BTG3水平从而抑制SGC-7901细胞侵袭及转移。本文尚存在不足之处，miR-373-5p对胃癌细胞活性及lncRNA MEG3对调控miR-373-5p的作用机制还不清楚，这是本文下一步研究方向，希望为胃癌的相关研究提供参考依据。