慢病毒介导的VEGF-RNAi对宫颈癌细胞C33A凋亡的影响

李 茸，王 娟

(西安交通大学第一附属医院肿瘤放疗科，西安 710061；*通讯作者,E-mail:wangjuan3890@163.com)

缺氧是实体瘤特异性的生理性异常。由于肿瘤的快速生长，实体瘤的体积不断增大，其组织内部无法获得足够的血液供应，出现氧的供求失调。正常组织中平均氧分压在40～60 mmHg，而将近50%的实体瘤中平均氧分压不足10 mmHg[1]。缺氧环境可诱导肿瘤生物学行为的适应和改变，这一影响主要表现在缺氧可诱导肿瘤细胞的基因组发生突变，并编码产生变异型蛋白，促进肿瘤细胞对缺氧环境的适应，主动逃避对其不利的环境，并增强其增殖能力，加速对周围组织的浸润以及转移[2]。随着缺氧时间的延长，肿瘤组织VEGF的表达进一步增强，促进了新生血管的发生。新生的滋养血管既为肿瘤组织带来了细胞生长、增殖所必需的氧气和营养物质，同时缓解因肿瘤组织快速生长而导致内部的缺氧状态，又为肿瘤细胞的血行转移提供了快捷通道。如果肿瘤的血管化程度越高，则患者预后越差，越容易发生远处转移[3]。VEGF及其受体通过介导血管内皮细胞表面的受体，导致血管内皮细胞的迁移和增殖，并且增强了血管的通透性，有利于肿瘤新生血管的生成[4]。如何高效地靶向抑制肿瘤细胞中VEGF基因的表达，进而阻断肿瘤血管生成信号或者直接作用于肿瘤血管内皮细胞，从而导致肿瘤细胞的凋亡，这有可能作为肿瘤治疗新的作用靶点。因此在本文的研究中，利用VEGF-shRNA慢病毒载体，探索慢病毒感染宫颈癌细胞C33A的适宜条件，同时观察病毒转染后VEGF基因沉默对宫颈癌细胞C33A凋亡的影响。

1 材料与方法

1.1 细胞株及主要试剂

宫颈癌细胞系C33A，由西安交通大学医学院中心实验室冻存，复苏后使用。促感染药物聚凝胺(Polybrene)和慢病毒载体系统购自上海吉凯基因技术有限公司。1640培养基、胎牛血清、DMSO和Trizol购自Gibco公司(美国)。0.25%胰酶，RIPA裂解液和Annexin Ⅴ-FITC凋亡检测试剂盒购自碧云天生物科技研究所。

1.2 细胞感染复数的测定

分别接种3×103～5×103个C33A细胞于96孔培养板各孔中，所加培养基体积为100 μl，细胞融合度为30%～50%时，进行病毒感染。干扰预试验分为对照组和实验组，每组均设置相同的梯度细胞感染复数(multiplicity of infection, MOI)值。对照组为正常情况下感染，即在完全培养基中直接加入病毒；实验组为感染时添加5 μg/ml的Polybrene，再加入病毒。感染前为细胞换液，吸去细胞上清，按不同分组情况加入所需的培养基90 μl，每组4个复孔。准备2个无菌的EP管，吸取10 μl×108TU/ml的病毒加入到第一个管子中，轻柔混匀。同样从第一管中吸取10 μl的病毒到第二管中，混匀。这样就得到了3个不同梯度的病毒：原液、10倍稀释、100倍稀释。同理稀释病毒液得到50倍稀释浓度。将上述4个不同梯度的病毒液，各取10 μl加到每组的4个孔中，则此时4孔的MOI分别为100，50，10，1。把细胞放回培养箱孵育。病毒感染12 h后观察细胞状态，病毒感染24 h后更换新鲜培养基。病毒感染72 h后，观察荧光表达情况。本小节的实验通过使用不同的病毒浓度，是否添加Polybrene，摸索慢病毒对C33A细胞的最佳感染条件。

1.3 病毒感染效率的检测

将处于对数生长期的C33A细胞胰蛋白酶消化，细胞计数后，用完全DMEM培养基(含10% FBS)将细胞浓度稀释至3×105/ml，移入无菌6孔板中，每孔2 ml；37 ℃，5% CO2饱和湿度条件培养箱中培养12 h后，更换培养液为含8 μg/ml聚凝胺的完全DMEM培养液(含10%FBS)，2 ml/孔，根据前述实验得到的MOI值，加入适量病毒液至6孔板内；37 ℃，5% CO2饱和湿度培养箱中继续培养72 h后荧光显微镜下观察，随机选取20个视野，分别在荧光以及可见光下计数表达绿色荧光细胞数与总细胞数，计算感染效率。

1.4 C33A细胞的感染

选取生长状态良好的C33A细胞，常规消化制备细胞悬液，细胞计数后以1×105/孔的浓度接种于6孔板中，放入CO2培养箱中继续培养24 h。按照“1.2细胞感染复数的测定”摸索出的最佳感染条件，感染C33A细胞。病毒感染12 h以后观察细胞状态，病毒感染24 h后更换新鲜培养基。病毒感染72 h后，观察荧光表达情况。

1.5 慢病毒干扰对C33A细胞VEGF蛋白表达的影响

大量培养C33A细胞，将处于对数生长期的C33A细胞分为3组：空白对照组(实验中使用普通培养基，不添加病毒干扰)、阴性对照组(使用含有无意义链shRNA-scr的慢病毒载体)、实验组(使用含有VEGF-shRNA的慢病毒载体)。按照前述实验(1.2细胞感染复数的测定)摸索出的最佳感染条件，按上述分组分别感染C33A细胞。病毒感染12 h以后观察细胞状态，病毒感染24 h后更换新鲜培养基。病毒感染72 h后，观察荧光表达情况。再次更换完全培养基，继续培养24 h后终止培养。

使用Western blotting检测C33A细胞的VEGF蛋白表达。每瓶细胞加入400 μl RIPA(混合裂解液)，裂解完后离心并提取细胞中的总蛋白。使用二辛可酸(bicinchoninic acid，BCA)法测定蛋白含量，分别配制工作液和稀释标准品，每管中加入200 μl BCA工作液，用酶标仪检测562 nm的OD值，根据得到的OD值编制标准曲线，再根据标准曲线计算样本的蛋白浓度。将已定量的蛋白样品5份加1份6×loading buffer(上样缓冲液)使其溶解充分，样品在沸水中加热让蛋白变性，计算出每个样本所需上样的体积。制备聚丙烯酰胺凝胶电泳并上样、转膜，放置5%脱脂牛奶中孵育。将VEGF兔抗人多克隆单抗(一抗)、兔抗人β-actin单克隆单抗分别稀释至1 ∶1 000～1 ∶2 000，将抗体溶液加到封口膜上，次日取出室温下用PBST(磷酸缓冲盐溶液)脱色摇床上洗涤。按上述方法稀释制备鼠抗兔二抗(1 ∶3 000)，与膜接触后用PBST液洗涤后进行化学发光。对胶片拍照或扫描，通过凝胶图像处理系统分析条带的分子量以及净光密度值。

1.6 流式细胞术检测干扰后C33A细胞的凋亡

实验分组和细胞感染方法同前，其中每组各设3个重复，独立重复试验。从病毒感染后72 h开始重新计时，分3个时间点即24，48，72 h时分别终止培养细胞，按Annexin Ⅴ/PI双染法检测细胞凋亡情况。

1.7 统计学分析

2 结果

2.1 C33A细胞的感染复数

根据上述的实验分组，在荧光显微镜下观测病毒感染后C33A细胞的荧光表达情况。当感染复数(MOI)为100，呈现较明显的细胞毒性，C33A细胞部分凋亡，失去贴壁能力而漂浮于培养液中；当MOI为10和1时，病毒数量不足以感染多数C33A细胞，荧光镜下绿色荧光细胞数量不足30%；当MOI为50时，细胞状态良好，未见明显凋亡，荧光细胞数量超过50%(见图1)。使用促感染剂Polybrene能够明显提高病毒的感染效率，当MOI=50且使用5 μg/ml的Polybrene时，慢病毒感染对C33A细胞无明显细胞毒性并达到最佳感染效果，荧光细胞数量超过80%，此时为C33A细胞的最佳感染条件。

A.5 μg/ml Polybrene+MOI 50 B.MOI=50C.MOI=10D.MOI=1图1 不同条件下慢病毒对C33A细胞的感染差异 (×100)Figure 1 Infection efficacy of lentivirus to C33A cells under different conditions (×100)

2.2 病毒的感染效率

按表1条件换算不同培养体系下的病毒用量。

表1 病毒感染细胞所用培养基体积和病毒量参考Table 1 Volume of medium and amount of virus for virus infection

通过计算GFP报告基因的表达情况可估算出慢病毒的感染效率，结果显示当MOI=50且使用5 μg/ml的Polybrene时，LV-VEGF-shRNA慢病毒载体的感染效率约为83%(见图2)。此时慢病毒对C33A细胞达到最佳的感染率，同时对细胞毒性最小，肿瘤细胞存活率最高。

2.3 慢病毒干扰下调C33A细胞VEGF蛋白表达

提取各组C33A细胞的总蛋白，Western blotting检测C33A细胞中VEGF蛋白的表达情况如下：各组细胞均有VEGF蛋白表达，将空白对照组的VEGF蛋白表达量设置为“1”，实验组VEGF蛋白表达量与阴性对照组相比明显降低(23.3%±1.2%vs96.7%±1.8%，P<0.05，见图3)。上述结果提示C33A细胞在慢病毒载体介导的shRNA干扰下，VEGF蛋白的表达量明显降低。

与阴性对照组相比，*P<0.05图3 Western blotting检测病毒感染后C33A细胞的VEGF蛋白表达情况Figure 3 Expression of VEGF protein in C33A cells after virus infection by Western blotting

2.4 干扰后C33A细胞的凋亡情况

流式细胞仪检测结果显示：在24 h时，实验组的细胞凋亡率高于阴性对照组，以早期凋亡为主(见表2，图4)。随着作用时间的延长，实验组细胞的凋亡进一步加剧，在72 h时细胞的总凋亡率(早期凋亡和晚期凋亡之和)达到46%，早期凋亡和晚期凋亡细胞均可见，凋亡率与阴性对照组相比有显著性差异(P<0.05)。阴性对照组在72 h时，亦有部分细胞凋亡出现，以早期凋亡为主。

图4 病毒感染不同时间后C33A细胞的凋亡Figure 4 Apoptosis of C33A cells at different time points after virus infection

表2 流式细胞术检测干扰后C33A细胞的总凋亡率 (%)Table 2 Apoptosis rate of C33A cells after interference by flow cytometry (%)

3 讨论

在正常情况下，血管生成是高度有序的过程，是在严格监管下同时进行诱导血管生成和抑制血管生成的协同过程。这些影响因素包括从细胞中分泌的可溶性生长因子[5]，如VEGF，血管紧张素、成纤维细胞生长因子(FGF)、血小板衍生的生长因子(PDGF)、转化生长因子(TGF-β)和膜蛋白结合分子(如整合素、钙黏素和ephrins等)。其他辅助细胞如毛细血管周皮细胞则起到血管支撑作用，并促进新生脉管系统的进一步发育成熟[6]。肿瘤细胞诱导血管生成的过程，模仿部分正常的血管生成过程，但肿瘤组织中VEGF的高水平表达赋予肿瘤血管其独特的性能[7]。VEGF及其受体的作用通过介导血管内皮细胞表面的受体，导致血管内皮细胞的迁移和增殖，并且增强了血管的通透性[8]。Olusola等[9]研究证明在原发性肿瘤中血管发生越多，肿瘤的预后就越差，这表明血管发生与肿瘤的转移有着直接的关系。因此，通过抑制VEGF的表达实现肿瘤的抗血管生成，能够抑制肿瘤的远处转移。

本研究成功构建了针对VEGF-shRNA慢病毒干扰载体，首先检测了C33A细胞的慢病毒感染复数MOI，本文中病毒MOI的测定是在96孔板中进行，下一步的实验反应体系将扩增。扩增的方法是保持细胞的密度，将培养基的体积按实际细胞数与预实验细胞数的比例放大，这样操作的结果可以保持病毒浓度不变[10]。当实验操作保持细胞密度不变时，就可以通过计算培养板中培养基的体积，而计算出细胞的总数。理论上加入相同浓度的病毒越多，被感染的细胞也会越多，但在实际操作中效果并不明显，因为慢病毒载体是一个接近100 nm大小的颗粒，在溶液上层中的病毒颗粒很少有机会接近细胞。感染时，减少培养基的体积反而能提高病毒的利用效率，相同的病毒在小体积中的感染效果要好于大体积中的。本文中最终验证在MOI为50的情况下且使用5 μg/ml的Polybrene时，慢病毒感染对C33A细胞无明显细胞毒性并达到最佳感染效果，感染效果超过80%。成功感染慢病毒后，C33A细胞VEGF蛋白的表达量明显降低，流式细胞仪检测结果显示感染后的C33A细胞凋亡率明显高于空白对照组，并随着作用时间的延长，细胞的凋亡进一步加剧，呈现明显的时间依赖性，因此通过RNAi沉默VEGF基因表达导致C33A宫颈癌细胞的凋亡。

同时我们发现携带有无意义shRNA的阴性对照组中，肿瘤细胞的生长同样受到了轻度的抑制，这可能和病毒对宫颈癌细胞的毒性有关，在使用大剂量病毒后，可能导致部分肿瘤细胞的凋亡，细胞分泌的减少导致了VEGF的表达下降[11]。这样的结果提示：相对于逆转录病毒载体(retrovirus，RV)、腺病毒载体(adenovirus，Ad)和腺相关病毒载体，慢病毒干扰载体因其较小的免疫原性和较高的病毒滴度，适合进行体内实验，而且慢病毒能够高效转染非分裂细胞和终末分化细胞，故尤其适用于其他方法难转染的原代细胞(如神经细胞、原代细胞和悬浮细胞)[12]。但在本实验中，当大剂量使用慢病毒载体时，仍然导致了部分肿瘤细胞的非预期凋亡，如何减轻慢病毒对肿瘤细胞的毒性作用，提高慢病毒针对肿瘤细胞的特异性，是下一步深入研究的方向。