芍药甘草汤提取物对H2O2 诱导心肌 细胞氧化应激和炎症反应的影响

刘金杰 贺 伟 彭心如 刘若萱 史 萌

河北北方学院中医学院，张家口，075000，中国

《难经·十四难》认为“损其心者，调其营卫”。后世宗《难经》之旨确立了“调和营卫、健脾益气”的缺血性心脏病治则，组方芍药甘草汤。芍药甘草汤源自张仲景《伤寒论》，由芍药和甘草两味药材组成，具有益营合血、调和肝脾、柔筋止痛的功效。依“谨守病机，异病同治”原则，该方临床应用广泛，对多种疾病疗效较好。现代药理研究表明，芍药甘草汤具有抗氧化、抗炎、止痛、抗心律失常、抗心肌缺血之功效［1-3］，但目前其在抗心肌缺血的作用机制研究并未明确。心肌缺血时会产生大量自由基，造成心肌细胞氧化损伤，诱发炎症反应，但目前尚不清楚芍药甘草汤提取物（SYG）对心肌细胞的保护作用是否与其抗氧化及抗炎作用有关。本研究拟采用过氧化氢（hydrogen peroxide，H2O2）诱导心肌细胞氧化损伤，从细胞及分子水平探究SYG 对心肌细胞氧化应激损伤及炎症反应的保护作用，为进一步完善芍药甘草汤的药理作用及指导临床合理用药提供依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验细胞

新生1～2 d 的Wistar 大鼠心肌细胞。

1.1.2 药品与试剂

芍药、炙甘草中药饮片，购于河北北方学院附属校医院；过氧化氢（H2O2），购自美国Hyclone；DMEM-H 液体培养基，购自美国Hyclone；新生胎牛血清，购自美国Gibco；0.25%胰蛋白酶溶液，购自美国Difco；四甲基偶氮唑盐（MTT），购于北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、过氧化氢酶（catalase，CAT）、乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LDH）和丙二醛（malondialdehyde，MDA）检测试剂盒，均购于南京建成生物科技有限公司；反转录试剂盒，购自美国Sigma；肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、诱导型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）、环氧合酶-2（cyclooxygenase-2，COX-2）、核因子κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB）引物，合成于北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司。

1.1.3 仪器

RE-52AA 旋转蒸发仪，上海亚荣生化仪器厂；DZF-6050 型真空干燥箱，宁波江南仪器厂；CO2细胞培养箱，Thermo；倒置荧光显微镜，Olympus；RT-PCR 测定仪，Therm7500；Nanodrop2000c 超微量分光光度计，Thermo。

1.2 实验方法

1.2.1 芍药甘草汤提取物的制备

称取芍药、炙甘草饮片各50 g，按照料液比为1∶7的比例采用70%乙醇进行提取，每次提取1 h，共提取3 次，收集3 次的提取液，采用旋转蒸发仪将提取液浓缩为浸膏，并最终得到干粉20.3 g，提取率为20.3%。

1.2.2 心肌细胞原代培养

取新生1～2 d 的Wistar 大鼠心室肌组织，剪碎，用含0.25%胰蛋白酶的Hank’s 液分别消化5、15、20 min，之后将三次细胞悬液混合在一起。预培养90 min 后，以3×105个·mL-1置入培养瓶内，在37℃、5% CO2和95% 空气的二氧化碳孵箱内进行培养，培养基为DMEM（含15%胎牛血清）［4］，本实验所有检测在心肌细胞培养4 d 细胞达融合状态后进行。

1.2.3 H2O2致心肌细胞氧化应激损伤模型的建立

参照文献［5］选取对数生长期大鼠心肌细胞，用0.25%胰蛋白酶Hank’s 液消化细胞，加入培养基制备细胞悬液，调整细胞密度为5×105个·mL-1，按照每孔100 μL的密度接种于96 孔板，采用终浓度为200 μmol·L-1H2O2诱导心肌细胞2 h，作为模型对照组。

1.2.4 分组与给药

将长势状态良好的细胞分成5 组：正常对照组、模型对照组、SYG 高、中、低剂量组。正常组为正常培养的心肌细胞；模型组为心肌细胞培养液中添加终浓度为200 μmol·L-1H2O2诱导大鼠心肌细胞2 h；SYG 高、中、低剂量组分别为采用150、100、50 μg·mL-1的SYG培养24 h 后，添加终浓度为200 μmol·L-1H2O2处理2 h。

1.2.5 MTT 法检测细胞增殖能力

选取各组对数生长期心肌细胞接种于96 孔板（5×105个·mL-1），每组设置3 个复孔，每孔加入20 μL 5 mg·mL-1MTT 溶液，继续培养4 h，弃去上清液，每孔加入二甲基亚砜（DMSO）150 μL，室温避光振荡孵育5 min，使结晶物充分溶解，用酶标仪在490 nm 处测定吸光度（absorbance，A）值。实验重复3 次。

各组细胞存活率按照如下公式计算：

细胞存活率（%）=（A 处理组-A 空白组）/（A 对照组-A 空白组）×100%，此方法用于细胞毒性实验的测定。

1.2.6 紫外分光光度法检测心肌细胞SOD、MDA、CAT、LDH 的含量

收集各组细胞培养上清液，参照试剂盒说明书，分别测定各组心肌细胞上清液中SOD、MDA、CAT、LDH相关氧化应激指标的含量。

1.2.7 RT-PCR 法检测心肌细胞中COX-2、iNOS、TNF-α、NF-κB 的含量

根据NCBI 公布的大鼠基因序列，设计上下游引物，如Tab.1 所示。

Tab.1 Gene name and sequence

培养24 h 后弃去细胞上清液，将细胞裂解，收集各组心肌细胞，采用Trizol 法提取心肌细胞中的总RNA，用Nanodrop2000c 超微量分光光度计检测RNA 浓度。参照反转录试剂盒将RNA 逆转录为cDNA。以cDNA为模板进行RT-PCR 反应，反应体系：SYBR Green Master Mix 10 μL，正反向引物0.8 μL，cDNA 2 μL，DEPC 水补足体系至20 μL；反应条件：95℃ 2 min，95℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，共40 次循环。

1.3 统计学方法

采用SPSS18.0 统计软件进行分析，计量资料以mean±SD 表示，多组间比较采用单因素方差分析，其中两两比较采用t检验法，P＜0.05 差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 心肌细胞存活率测定结果

实验结果显示，与正常对照组比较，终浓度为200 μmol·L-1的H2O2处理后心肌细胞存活率显著降低（P＜0.01，Fig.1）。

Fig.1 Effects of SYG and H2O2 on cardiomyocyte proliferation

2.2 心肌细胞上清液中SOD、MDA、CAT 和LDH 测定结果

SOD、MDA、CAT 和LDH 含量能够反应心肌细胞氧化应激损伤程度，实验结果显示，与正常对照组相比，模型组能够显著降低心肌细胞上清液中SOD 和CAT 的含量（P＜0.01），SYG 各剂量组能够不同程度改善上述状况，且与模型组相比有显著性差异（P＜0.05，P＜0.01）。与正常对照组相比，H2O2模 型组能够显著性升高心肌细胞上清液中MDA 及LDH 的含量（P＜0.001），SYG 各剂量组干预后能够显著性降低心肌细胞上清液中MDA、LDH 的含量，且与模型组相比有显著性差异（P＜0.05，P＜0.01，Fig.2）。

Fig.2 Effect of SYG on the contents of LDH，SOD，MDA and CAT in the supernatant of H2O2-induced cardiomyocytes

2.3 心肌细胞中TNF-α、COX-2、iNOS、NF-κB 含量测定结果

TNF-α、COX-2、iNOS、NF-κB 是重要的炎症因子与炎症介质，其含量的高低与炎症程度成正相关。实验结果显示，相对于正常组，模型组心肌细胞组织中TNF-α、NF-κB、COX-2 和iNOS 炎症因子mRNA 含量显著升高（P＜0.05，P＜0.01），SYG 高、中、低剂量组能使COX-2 和iNOS mRNA 表达量降低（P＜0.05，P＜0.01），SYG 高、中剂量组能使TNF-α mRNA 表达量降低（P＜0.05），SYG 中、低剂量组能使NF-κB mRNA 表达量降低（P＜0.05，Fig.3）。

Fig.3 Effects of SYG on the expression of inflammatory factors TNF-α，COX-2，iNOS and NF-κB in H2O2-induced cardiomyocytes

3 讨论

大量研究证实心肌缺血时会产生大量自由基，造成心肌细胞氧化损伤，诱发炎症反应［6］。在正常生理状态下，机体内的氧化剂与抗氧剂之间存在着动态平衡，维持机体的正常生理功能，一旦心肌细胞受损会使机体内氧化剂与抗氧剂之间的动态平衡被破坏，使得心肌细胞内产生大量的自由基，诱发氧化应激，进而发生一系列的炎症反应，影响机体的各项功能［7］。在氧化应激反应中，H2O2作为一种重要的活性氧，在体内氧化代谢起着非常重要的作用，其可以诱发机体内的核酸、蛋白等发生不同形式的氧化反应，引发炎症反应或细胞死亡［8］。本研究以H2O2诱导心肌细胞模拟心肌缺血后引发的系列氧化应激及炎症反应，用以评价SYG 对心肌缺血的影响。

氧化应激反应与心肌细胞损伤密切相关，是缺血性心脏病发生发展的关键因素［9］。氧化应激包括氧化产物生成的增加和抗氧化酶活性的降低。SOD 作为机体内的一种抗氧化酶，能消除生物体在新陈代谢过程中产生的有害物质活性氧簇（reactive oxygen species，ROS），减轻氧化应激反应［10］。MDA 是细胞膜脂质过氧化过程中稳定的代谢终产物之一，其含量的高低能够反应体内脂质过氧化的程度，从而反应体内ROS 的水平。CAT 作为H2O2分解的催化酶能够使得H2O2快速转化为其他无害或较小毒性物质，减轻其对机体的危害［11］；LDH 在机体内的各个细胞中都有存在，是催化乳酸进行氧化反应的催化酶，其漏出量的增加，往往标志着心肌细胞受到了不可逆的损伤［12］。本实验结果显示，经过SYG 干预后，各剂量组能够不同程度的增加H2O2诱导所致的SOD、CAT 的降低，能够降低H2O2诱导所致的MDA、LDH 的增加，在一定程度上显示出较强的抗氧化应激的作用。

TNF-α作为一种促炎因子其可以激活经典的NF-κB 信号通路。NF-κB 信号通路在免疫、炎症、应激反应中均起到了重要的作用，其可以被促炎因子、脂多糖、生长因子等物质激活，由细胞质进入到细胞核，进而诱发炎症因子如：iNOS、COX-2 等的表达［13-15］，从而诱发炎症反应。本实验结果显示，SYG 能够显著性降低H2O2诱导后心肌细胞内TNF-α、iNOS、COX-2 及NF-κB mRNA 的表达，显示出一定的抗炎作用。

综上所述，SYG 能够抑制H2O2诱导后心肌细胞的氧化应激反应及炎症反应，对心肌缺血有一定的保护作用，根据实验结果推测其抗炎作用机制可能为抑制TNF-α激活NF-κB 信号通路，从而抑制iNOS 及COX-2 的表达，但具体作用机制仍需进一步明确。课题组在后期的研究中将继续深入研究SYG 对氧化应激及炎症反应的保护作用机制，力求全面阐释SYG 对心肌缺血保护作用，为芍药甘草汤的临床应用提供可借鉴的实验依据。