雪茄烟叶晾制过程中颜色变化探讨

王 佩 贾世伟 冯俊升 段宏群 王 宏 孔德辉 周中宇*

（1河南农业大学烟草学院，河南郑州 450002；2河南中烟工业有限责任公司，河南郑州 450016；3河南省烟草公司洛阳市公司，河南洛阳 471000）

雪茄烟是一种不同于其他类型卷烟的烟草制品。传统概念的雪茄是指由雪茄烟叶完全手工卷制的圆形或方柱形烟支，具有香气醇厚丰满、劲头大、吃味浓、烟气呈碱性、焦油与烟碱比值低、抽吸时不过肺、对人体危害小等特点[1]。现有的雪茄烟制品结构从内到外依次是茄芯、茄套和茄衣。一般一株烟可以产生3种烟叶，即顶部叶做茄芯，中下部叶做茄套和茄衣[2]。一般对茄衣的外观要求极高，它包裹在雪茄烟支的最外层，具有保护和美化雪茄以及提升雪茄品质等功效，代表了雪茄烟支的身份和品质[3]。国内茄衣和茄套常采用晾烟，茄芯可以是品质较好的晒烟或者晾烟。

在雪茄烟晾制过程中，其颜色变化是烟叶调制过程中的一个难点。国内外对其颜色变化的机理研究较少，因而本文从一些容易发生褐变的食品、植物入手，论述其在生产中颜色变化的原因，从而为雪茄烟晾制过程中控制颜色变化提供一些参考。

1 变色的原因

1.1 色素降解

果蔬的色泽是构成其产品品质的重要因素，其表面的绿色主要来源于叶绿素。叶绿素降解是一种非常普遍的自然现象，在秋季树木落叶、作物衰老、果实成熟等情况下或者遭受生物与非生物胁迫时，如低温、虫害、微生物侵染等，都有可能发生[4]。叶绿素降解在绿色植物生长发育过程中起着至关重要的作用，包括营养代谢、果实和种子成熟。这不仅是叶绿素-蛋白质复合物分解的先决条件，也是衰老器官中大量营养物质再动员的先决条件。

梁俊林等[5]分析了不同颜色银杏叶片中叶色素以及其他色素等含量，结果表明，引起银杏叶变黄的最直接原因是类胡萝卜素和花色素苷相对含量的增加。叶绿素的降解途径有2条：一是光降解，二是叶绿素酶降解。汪 洋等[6]研究了光照对新鲜青花椒干燥过程中叶绿素降解的影响，结果表明，在紫外光干燥条件下，青椒表面的绿色逐渐褪去，并在干燥结束后，其色泽从绿色变为褐色。叶绿素及其衍生物都在一定程度上降解了一部分。果蔬类表面的绿色也会随着自身的衰老而褪去。樊艳燕等[7]研究了青花菜衰老过程中叶绿素的降解及其相关基因的表达，结果表明，脱镁叶绿素酶基因BoPPH和叶绿素酶基因BoCLH2会共同加快叶绿素降解。田雪婷等[8]研究了1-MCP处理对采后澳洲青苹苹果叶绿素降解的影响，结果显示，1-MCP可以调控叶绿素降解相关基因，其中MdPAO是调控叶绿素降解的关键基因。宋小青等[9]研究表明，在猕猴桃果实贮藏过程中，叶绿素降解主要受叶绿素酶（chlase）和脱镁螯合酶（MDCase）的影响。

烤烟在调制过程中随着环境温湿度的改变，色素也发生相应的降解。研究表明，烟叶在变黄期间，叶绿素降解量最大，一直持续至干筋期，仍可以缓慢降解；类胡萝卜素随着烘烤时间的延长降解量逐渐减小，总体来说，调制后的烟叶类胡萝卜素相对含量较叶绿素高[10]。白肋烟晾制期间叶绿素a、叶绿素b、类胡萝卜素等在叶绿素酶、过氧化物酶等的作用下发生降解，在0～3 d内下降速度最快，叶绿素a/叶绿素b的比值随晾制时间的延长而下降；随着叶片部位的升高，色素降解量也呈现增加趋势，即上部叶＞中部叶＞下部叶[11]。白肋烟在不同晾房内晾制时，叶绿素总量、叶绿素a含量、叶绿素b含量均在晾制7 d后低于类胡萝卜素含量，叶绿素含量大幅降低而类胡萝卜素含量略有降低，叶绿素与类胡萝卜素含量的差异较大，验证了烟叶由绿变黄的生理过程[12]。向欢等[13]研究了光照对晒烟变黄期叶绿素荧光的影响，结果显示，烟叶中的叶绿素在变黄初期仍然可以吸收利用光能，从而促进细胞内物质的转化。

1.2 酶促褐变

刘红锦等[14]认为，果蔬褐变与细胞采后失水、衰老、不合适的温度和氧气浓度以及其他逆境胁迫等有关。酶促褐变是指在有氧条件下，酚酶催化酚类物质形成醌及其聚合物的反应过程。烟叶因饥饿代谢而消耗大量的内含物质，因而烟叶的颜色会随之发生变化。随着晾制时间的增加，烟叶细胞逐渐死亡，细胞膜失去了选择透过性，使得原本位于液泡内的多酚类物质与位于质体内的多酚氧化酶（PPO）相结合，在氧气的作用下，生成醌类化合物，而醌类化合物进一步聚合，与细胞内氨基酸生成黑色素沉淀[15]。如板栗的褐变主要发生在板栗果肉外表，在细胞受损之后，PPO、POD与果蔬组织中的内源性多酚物质如儿茶酚、单宁、花青素、酪氨酸、绿原酸等相互接触，细胞内的氧化还原平衡被打破，氧气进入，酚类物质氧化形成醌类化合物，醌再聚合形成褐色素或者黑色素，导致褐变的发生[16]。

雪茄烟叶的酶促反应主要发生在变黄末期、变褐期。适度的酶促棕色化反应有利于改善雪茄烟的外观颜色。一直以来，对果蔬类防酶促褐变的研究都有很多，而促酶促褐变的研究较少。在一些食品加工过程中，适当的褐变是很有用的，如酱油、咖啡、红茶、啤酒的生产和面包、糕点的烘烤。

酶促反应的发生需具备3个条件：底物、氧气和酚氧化酶。3个条件缺一不可，否则酶促反应便不能发生。有研究认为，绿原酸、儿茶素是PPO的良好褐变底物，是引起果实褐变的主要酚类物质。与酶促反应相关的酶类有 PPO、SOD、CAT、POD、PAL、APX等，其中PPO、POD和CAT是与膜保护系统相关的酶，与植物衰老有关。国内外对烟草中PPO、POD和CAT酶活性的研究较多[17-19]，但对苯丙氨酸解氨酶（PAL）的研究较少。另有研究证明，PAL与酚的生成有关，表明了其与褐变关系密切[20]。PAL是一种只存在于植物及微生物细胞内的酶，它是连接生物初级代谢和苯丙烷类代谢、催化苯丙烷类代谢第一步反应的酶，也是苯丙烷类代谢的关键酶和限速酶[21]。PAL活力往往作为酚类褐变的指标，它可以通过催化植物体内次生代谢产物酚类物质的产生而影响酶促褐变[22]。

在鲜芋[20]、山药[23]、奉节脐橙[24]等植物中 PAL 影响褐变的研究较多。鲜切芋艿切分后当天测得的PAL活力最高，随后迅速下降；脐橙果皮在褐变初期，PAL活性急剧上升，但在整个贮藏过程中PAL活性相对较稳定；Nguyen等[25]指出，低温下贮藏的香蕉皮中PAL活力呈逐渐上升趋势；范 腾等[26]研究胡萝卜中PAL特性，结果表明，PAL酶活力随着温度上升而升高，当温度40～50℃时酶活力较高，然后逐渐下降。冯立娟等[27]研究显示，在石榴发育前期，PAL表现出较强的活性，进而促进了花青苷和木质素等次生代谢物质的合成；随着木质素不断生成，细胞分化伴随着程序性死亡，果皮细胞内的活性物质不断向外运输，酶活性降低，木质素沉积，木质素后期沉积可能以酚类物质向木质素转化途径为主。但是，PAL与烟草褐变的关系至今仍未见报道，因而可以对雪茄烟晾制阶段PAL与酶促变化的关系进行进一步探索与研究。

1.3 非酶褐变

非酶褐变是指在没有酶类物质参与下发生的化学反应，使果肉或者果皮褐变的现象，主要发生在果蔬的采后加工和贮藏过程中。非酶褐变包括美拉德反应、多酚类物质氧化缩合、抗坏血酸氧化分解和焦糖化反应等几种类型[28]。

美拉德反应是羰基化合物和氨基化合物之间的反应，经过一系列复杂的反应最终生成棕色甚至是黑色的大分子物质类黑精或称拟黑素，所以又称羰氨反应。许多研究表明，美拉德反应是使一些果汁浓缩汁颜色发生变化的原因，在橙汁加工和贮藏过程中发生的褐变反应是非酶褐变（NEB）。贮存期间的颜色评估表明，橙汁和含可溶性化合物的馏分变为棕色，而不溶性馏分未变为棕色。含有可溶性化合物的馏分显示出与纯橙汁完全相同的褐变行为。根据获得的动力学参数可以发现，原味橙汁和含可溶性化合物的氨基酸在降解过程中，蔗糖的水解、葡萄糖和果糖含量的增加以及糠醛和5-羟甲基糠醛的形成相似[29]，而VC的降解是影响橙汁贮藏过程中褐变的主要因素[30]。研究表明，在存储期间，东北酸菜中也很容易发生非酶褐变反应，还原糖和氨基酸在酸性条件下会发生褐变反应生成代表性产物5-羟甲基糠醛（5-HMF）[31]。美拉德反应还发生在香蕉汁贮藏过程中[32]。多酚的氧化聚合是苹果汁加工过程中非酶褐变的主要原因[33]。朱 丹等[34]研究表明，美拉德反应是毛酸浆发酵期间非酶褐变的主要原因。连志超[35]研究表明，百香果汁在贮藏过程中VC的氧化分解以及美拉德反应是造成非酶褐变的主要原因。

非酶褐变在果汁贮藏中比较常见。糖类物质在果汁中的含量丰富，焦糖化反应就是指一部分糖类物质与氨基化合物发生反应，其余一部分在加热条件下脱水，发生热分解反应，从而使果汁颜色发生变化的过程。果汁中含有丰富的VC等抗坏血酸物质，这种物质因具有酸性和还原性，因而特别容易氧化分解，能够和游离氨基酸反应生成色素类物质。多酚类物质氧化缩合是指多酚类物质在适当条件下容易发生自身氧化缩合生成褐色物质。一些单宁成分含量较高的水果，如野梨、葡萄、柿子等在加工过程中都容易发生氧化变质，生成褐色物质。一般认为5-HMF是葡萄糖或果糖在酸性条件下脱水分解的产物，是美拉德反应、焦糖化反应及抗坏血酸氧化反应共同的中间产物。有研究指出，5-HMF的积累与褐变速度有很强的相关性，5-HMF积累后不久就可发生褐变，因而5-HMF积累情况可以作为非酶褐变速度的指标[36]。在非酶褐变反应动力学中，抗坏血酸含量是影响褐变反应的特定参数之一[37]。因此，检测藕带中抗坏血酸含量的变化，对解析非酶褐变的机理具有重要意义。

非酶棕色化反应是形成烟草特征香味的重要反应，在烟草调制、陈化、加工以及燃吸过程中，都不同程度地发生非酶棕色化反应，生成多种烟草香味物质[38]。但是，烟草中非酶棕色化反应的研究较少，因而可以在雪茄烟调制过程中探究非酶褐变和烟叶颜色的相关性，可以通过测定雪茄烟晾制过程中每个阶段完成后样品中的游离氨基酸、糖、氨基态氮、抗坏血酸、总酚、5-HMF含量以及观察烟叶颜色的变化，从而分析在每个阶段所发生的非酶褐变反应。

1.4 膜脂过氧化

细胞内发生膜脂过氧化作用其实是细胞在某一逆境条件下受到胁迫导致活性氧自由基增加，以此来进一步破坏细胞膜，最终使植物受到伤害的过程。范宁波等[39]研究表明，在雪茄烟晾制过程中，随着烟叶变褐程度的加深，细胞逐渐失水干瘪，细胞内发生失水胁迫，膜通透性发生改变，膜脂含量也急剧下降，这表明在烟叶调制过程中发生了膜脂的降解。赵松超等[40]研究表明，随着雪茄烟叶晾制的进行，低晾制密度处理的晾房内温度升高、湿度降低，烟叶细胞失水皱缩，在高温和失水胁迫下，烟叶体内产生了许多活性氧，破坏烟叶体内的抗氧化酶系统，从而使膜系统受到损伤。

不仅是雪茄烟叶的变褐与膜脂过氧化作用有关，水果果心的褐变也与细胞衰老、膜脂过氧化伤害、冷害等因素有密切关系。膜脂过氧化作用是果实衰老和褐变的重要原因，而引起膜脂过氧化作用的主要原因是活性氧的积累。在荔枝、猕猴桃、香蕉和梨等的褐变过程中，活性氧清除酶如超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）、过氧化氢酶（CAT）活性下降，内源抗氧化物质如还原型谷胱甘肽（GSH）、还原型抗坏血酸（AsA）含量下降，而膜脂过氧化物（ROOH）、H2O2和超氧阴离子自由基（O2-·）大量积累，导致膜脂过氧化产物丙二醛含量明显增加，细胞膜透性改变。这表明果实褐变是由于内源消除活性氧的功能减弱、内源抗氧化能力下降使得活性氧得以积累，使得细胞膜系统膜脂过氧化作用加强，破坏了细胞膜结构的完整性导致的。因此，果皮褐变与过氧化作用和膜损伤有关[41]。

在陈 娜等[42]研究中，可以发现南果梨褐变过程中会产生较多的α-法尼烯和共轭三烯，增加过氧化物酶的活性，促进膜脂过氧化，使丙二醛含量上升，从而使果皮发生褐变。有研究表明，黄金梨果心褐变与果实衰老存在很大关系，在黄金梨低温贮藏前期，抗氧化酶活性增加来清除自由基，后期抗氧化酶活性下降，细胞加速衰老，细胞膜透性增加，膜脂过氧化作用加强，丙二醛含量迅速增加，表明果心细胞膜受到损伤，果心变褐[43]。不论是果皮还是果心的颜色变化都说明褐变与膜脂过氧化密切相关。

同时也有众多研究表明，LOX、CAT、APX和GR活性变化可能与荔枝果皮褐变有关。有研究者探讨了LOX与果皮褐变的关系，认为LOX是导致果蔬衰老的一个关键酶，在果实衰老过程中LOX活性显著增加，它通过破坏果实质膜使得机体成熟与衰老。同时，脂质过氧化的产物对有机体的活性生物大分子有毒害作用，导致细胞功能丧失[44-45]。在阚 娟等[46]对百合鳞片的研究中发现，褐变最快的内层鳞片在贮藏过程中LOX活力峰值最高且上升速率较快，说明LOX活力与百合鳞片褐变关系密切。低温下APX等保护酶系统被破坏或活性变化不协调，导致积累许多有害的过氧化产物丙二醛（MDA），损伤生命大分子物质，引起一系列生理生化紊乱，最终导致膜损伤和褐变发生[47-48]。膜脂过氧化和这些酶活性变化与不同品种褐变过程差异的关系还需要进一步研究。

2 结论

本文以树叶颜色变化以及一些蔬菜水果的褐变为出发点，探讨了色素降解、棕色化反应以及膜脂过氧化与颜色变化的关系。在雪茄晾制过程中，色素类物质如叶绿素、类胡萝卜素等发生降解，但叶绿素降解量远远高于类胡萝卜素降解量，因而烟叶逐步呈现黄色。紧接着随着晾房内温湿度的变化，烟叶细胞失水皱缩，烟叶体内发生失水胁迫和高温胁迫，促进活性氧自由基的积累，破坏膜系统，一方面使细胞受到损伤，一方面由于膜系统被破坏，细胞内的抗氧化性酶类与多酚类等物质接触，发生棕色化反应，烟叶变褐。雪茄烟属于晾晒烟，其晾制后的颜色需要呈深褐色，因而在其调制过程中应充分把握好变褐的度，充分了解调制过程中烟叶体内发生的色素降解，进而更好地调控晾制过程中颜色变化。现有的研究中都只研究了晾制过程中酶促反应对烟叶品质的影响，而忽略了非酶促反应的影响，因而接下来可以研究晾制过程中非酶促反应对雪茄烟叶的影响，并进一步与酶促反应对烟叶品质的影响进行比较，探索在雪茄烟叶晾制过程中非酶促反应的作用。总之，烟叶的颜色变化是一个复杂的过程，需要更进一步的探索。