液液微萃取结合GC-MS-SIM法检测酱香型白酒中15种微量成分含量

陆伦维，孙优兰，王金龙，韦露露，尹延顺，程平言，胡 峰

（贵州茅台酒厂（集团）习酒有限责任公司，贵州习水 564622）

酱香型白酒是以高粱为主要原料，以高温大曲作为糖化发酵剂，采用固态发酵方式，经蒸煮、糊化、糖化、蒸馏、储存和勾调等步骤而形成的蒸馏酒，其工艺复杂性在中国白酒行业内具有唯一性[1]。在蒸馏、勾调及贮存体系中，为白酒带来了丰富的微量成分。这些成分或构成白酒骨架香气，或赋予白酒独特风格和口感，或赋予白酒多种功效作用[2-4]。

近年来，许多学者对酱香型白酒与人体健康的关系进行了深入研究，特别是吡嗪类和酚类化合物[5]。白酒中的吡嗪类化合物是由美拉德反应和芽孢杆菌代谢产生。吡嗪是1,4 位含氮的六元杂环化合物，其衍生物广泛存在于天然和发酵食品中，具有类似于炒坚果、烤肉的怡人香气[6]，由于它们具有极低的风味阈值，还对其他香味物质有明显的烘托作用，可使白酒的香气更为丰满，对白酒风味有重要贡献[7-8]。另外，吡嗪还略带广藿香、香草根及薄荷香味，用于制作香水，具有强烈、自然、持久的效果[9]。

吡嗪类物质作为白酒中一类重要的健康功能因子，很多专家学者对其进行了研究。李大和等[10]阐述了白酒中的功能性成分对人体生理功能有一定影响；孙宝国等[11]对白酒中有益成分及其功效进行了系统综述，其中的有益成分主要包括低分子有机酸、内酯类、酚类、杂环类、氨基酸和微量元素等；徐岩等[12]对酱香型、浓香型和董香型白酒中的生物活性成分进行了系统研究，主要包括萜烯类、吡嗪类以及多酚类化合物；罗强等[13-14]证明了酱香型高温大曲白酒中吡嗪类物质具有体外抗炎活性和对幽门螺杆菌代谢物诱导人胃上皮细胞炎症的抑制作用。除此之外，一些含吡嗪的天然产物对人类的醛糖还原酶(ALR2)有抑制活性，有助于减轻糖尿病并发症[15]。研究表明，吡嗪类化合物具有扩张血管、促进血循环、改善学习障碍、护肝等功能[12]，近年来成为白酒健康养生领域的一个研究热点。

酚类亦称为多酚，是芳香烃环上氢被羟基取代的一类芳香族化合物[16]，广泛存在于酿酒原料中，如葡萄、大麦等各种酿酒谷物[17-20]。酚类物质是由酿酒原料中的单宁、木质素、蛋白质等物质分解而来，或经由发酵过程中微生物直接代谢生成，或是由酿造过程中形成的氨基酸和阿魏酸等中间产物经酵母菌或细菌代谢生成[21]。挥发性酚类化合物是白酒中的重要香味组成部分，对于白酒的闻香、口味及稳定性等方面均具有重要的作用。挥发性酚类化合物在白酒中的含量极少，但呈香作用却很强，在几百万分之一甚至千万分之一就能使人感觉到强烈的香气[22]。酚类物质为白酒提供了独特的烟熏风味、焦酱味、奶香味和窖泥味等，是白酒主要的风味组成[23-27]。

酚类化合物不仅是白酒中重要的风味物质，更是一类具有生理活性的功能成分。4-甲基愈创木酚和4-乙基愈创木酚不仅是良好的抗氧化成分，还可以预防疾病、延缓衰老、增强机体免疫力、抗肿瘤、降低血糖活性[28-31]；苯酚作为阿司匹林及磺胺药等医药的原料，也具有一定的医用价值；愈创木酚可用于慢性支气管炎多痰咳嗽的治疗；麝香草酚具有抗菌活性、祛痰治咳等作用[32]；异丁香酚具有抗氧化、防腐功效[33]。

液液微萃取最大的优点是萃取时间短，且该方法集采样、萃取和浓缩于一体，具有快速、成本低、富集效率高、有机溶剂用量少的优点[34-35]。本研究建立了液液微萃取结合GC-MS-SIM 法快速检测酱香型白酒中15 种吡嗪和酚类化合物的检测方法，并对12 个酱香型白酒中吡嗪和酚类化合物的含量分布进行了统计分析。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂及仪器

酒样：见表1，均购于市场。

表1 21个酱香酒样信息

试剂：无水乙醇（色谱纯），默克公司；乙醚（色谱纯，纯度≥99.5%），重庆川东化工有限公司；正己烷（色谱纯，纯度≥99.5%），安徽天地高纯溶剂有限公司；氯化钠（分析纯，纯度≥99.5%），成都金山化学试剂有限公司；标准样品2-甲基吡嗪（≥98.0%）、2,5-二甲基吡嗪（≥98.0%）、2,6-二甲基吡嗪（≥98.0 %）、2-乙基吡嗪（≥99.0 %）、2,3-二甲基吡嗪（≥95.0%）、2,3,5-三甲基吡嗪（≥98.0%）、2,3-二乙基吡嗪（≥98.0 %）、2,3-二甲基-5-乙基吡嗪（≥98.0%）、2,3,5,6-四甲基吡嗪（≥98.0%）、愈创木酚（≥98.0%）、4-甲基愈创木酚（≥98.0%）、4-乙基愈创木酚（≥97.0%）、苯酚（≥98.0%）、4-甲基苯酚（≥99.0%）、4-乙基苯酚（≥97.0%），ANPEL公司。

仪器设备：7890A-5975C 气相色谱质谱联用仪，美国安捷伦科技有限公司；MPS2多功能自动进样系统，德国Gerstel 公司；电子天平AR2130/C，上海奥豪斯公司；QT-1 旋涡混合器，上海琪特分析仪器有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 标准样品配制

称取不同质量的各标准样品于100 mL 容量瓶中，加入53%vol 乙醇水溶液进行溶解并定容至刻度线，得到混合标样母液。取混合标样母液1 mL于50 mL 容量瓶中，加入乙醇水溶液稀释定容，得到稀释的混标溶液；将混标溶液分别稀释1 倍、2倍、4 倍、8 倍、16 倍、32 倍、64 倍作为梯度标准溶液备用。

1.2.2 样品前处理

取2 mL 酒样于25 mL 具塞试管中，用饱和氯化钠溶液将其稀释至10%vol左右，旋涡混匀，加入2 mL 萃取剂（乙醚∶正己烷=1∶1）进行萃取，涡旋振荡混匀1 min，静置分层5 min，取上清液于样品瓶中上机分析。

1.2.3 GC-MS分析检测

色谱分析条件：安捷伦DB-FFAP 毛细管色谱柱（60 m×0.25 mm×0.25 μm）；进样口温度250 ℃，载气为氦气，流速1.2 mL/min，不分流模式，进样量2 μL；升温程序：起始40 ℃，保持1 min，以8 ℃/min升温至80 ℃，不保持，以2.5 ℃/min 升温至115 ℃，不保持，以8 ℃/min 升温至155 ℃，不保持，再以5 ℃/min升温至220 ℃。

质谱分析条件：传输线温度250 ℃；EI 离子源；离子源温度：230 ℃；电子能量：70 eV；四级杆温度150 ℃。溶剂延迟7 min；定性采用全扫描模式，扫描范围30.00～350.00 amu。

1.2.4 定量分析

定量采用SIM 模式，SIM 参数见表2。以待定量物质峰面积（y）为纵坐标，待定量物质质量浓度（x）为横坐标建立标准曲线，线性相关系数进行评估。

表2 选择离子检测模式参数

1.2.5 数据处理

数据统计分析及表格制作采用软件Microsoft Excel。

2 结果与分析

2.1 总离子流图及标准品质谱图

利用标准样品，根据上述质谱条件，所得总离子色谱图及标准样品质谱图如图1和图2所示。

图1 15种标准样品总离子流色谱图

2.2 线性范围、检出限和定量限

将7 个梯度的标准样品混合液进行GC-MS 分析，以质量浓度-峰面积进行线性回归，绘制标准曲线，15 种标准样品在各自的线性范围内R2均大于0.9990，线性关系良好。通过添加标准样品和重复进样计算样品加标回收率和仪器精确性，结果见表3。结果表明，15 种标准样品的相对标准偏差均低于5.00 %，加标回收率在84.23 %～98.85 %之间，表明该方法对于检测这15 种标准样品具有很好的准确性和精确性，完全能够满足分析要求。

表3 15种标准样品的线性范围、回归方程、相关系数、检出限及定量限

2.3 样品检测结果

按照试验方法分析定量12 个酱香型白酒中9种吡嗪和6 种多酚含量，结果如表4 和表5 所示，典型的总离子流图见图2。

表4 酒样中9种吡嗪定量结果

表5 酒样中6种多酚定量结果

图2 典型样品总离子

四甲基吡嗪又称川芎嗪，可通过微生物代谢和美拉德反应产生，对酒体贡献甜香、水果香及花香，具有抑制血小板聚集、改善微循环及降低脑萎缩伤害等生理功效。四甲基吡嗪在吡嗪类物质中含量最高，12 个酱香型白酒中均有检出，但不同样品中含量差异较为显著，总体上看，省外酒样含量相对较低。其中，JX-8 酒样中四甲基吡嗪含量最高，达8.10 mg/L；JX-5 和JX-9 样品中四甲基吡嗪含量均高于3 mg/L，相对较高；其余酒样均低于1 mg/L，相对较低。2,3-二乙基吡嗪由于含量较低，在所有酒样中均未检测到，其他吡嗪类物质均在酒样中检测到。除四甲基吡嗪外，其他含量较高的吡嗪类物质有2,6-二甲基吡嗪、三甲基吡嗪、2,3-二甲基-5-乙基吡嗪和2-甲基吡嗪，2,3-二甲基吡嗪和2-乙基吡嗪含量相对较低。从吡嗪类总含量来看，12个酱香型白酒中吡嗪类物质含量范围为1.00～11.89 mg/L，JX-8酒样最高，JX-2酒样最低，差异较为显著。

酚类物质是由高粱、小麦、大曲等酿酒原料中的单宁、木质素、蛋白质等物质分解而来，或经由发酵过程中微生物直接代谢生成，或是由酿造过程中形成的氨基酸和阿魏酸等中间产物经酵母菌或细菌代谢生成。4-甲基愈创木酚和4-乙基愈创木酚是优良的自由基清除剂，具有抗氧化、抗肿瘤、抗菌、抗病毒、提高免疫力、阻断致癌物形成等功能。在12个酱香型酒样中均检测到6 种酚类物质，但总含量相对较低，苯酚在酚类物质中含量最高，4-甲基愈创木酚和4-乙基愈创木酚含量相对较低。从酚类物质总含量来看，其含量范围为0.32～0.84 mg/L，JX-4 酒样最低，JX-12 酒样最高，酚类物质总含量在所有酒样中差异相对较小。总之，由于酿酒原料、操作工艺和微生物环境等差异，导致了不同厂家或地区的酒样中吡嗪类物质和酚类物质的含量差异，进而影响了酒体风格特征和质量。

3 结论

GC-MS-SIM 方法具有检测快速、准确性高、专一性强等优点，应用该方法结合液液微萃取对12 个酱香型白酒中的15 种微量成分进行了定量分析。结果表明，在酱香型白酒中，四甲基吡嗪是含量最高的吡嗪类物质，2，6-二甲基吡嗪和三甲基吡嗪含量也相对较高，2,3-二乙基吡嗪因含量较低未在上述酒样中检出，不同酒样中吡嗪类物质含量差异较大。酚类物质中苯酚含量相对较高，4-甲基愈创木酚和4-乙基愈创木酚含量相对较低，整体而言，酚类总含量均较低，但因为其阈值相对较低，对酒体风味仍然有较大贡献。上述研究结果可为白酒微量成分研究提供借鉴和参考，白酒中微量成分还有很多值得研究之处，特别是其产生机制、作用机制、拮抗机制及白酒与健康研究等，这是中国白酒研究人员现阶段甚至未来几十年的研究重点领域之一，也是中国白酒进军世界的关键研究点。