滴定法测定羧甲基壳聚糖取代度的方法改进

肖莉，李辉，张堃

（爱美客技术发展股份有限公司，北京 101204）

羧甲基壳聚糖为壳聚糖氨基糖单元的6-OH上的H被羧甲基取代后的产物，通过取代度，即样品中羧甲基的总摩尔数占试样中总的氨基糖单元摩尔数的百分数，来衡量羧甲基壳聚糖羧甲基化的程度。

《医用羧甲基壳聚糖》（YY/T 0953—2020）中附录B提供了取代度的测定方法[1]，实际操作时，因第一拐点突跃较小且不明显，往往不能在滴定曲线上直接读取，甚至在原始数据中也不能确定第一拐点值。因此，业内对羧甲基壳聚糖产品取代度测定的难点多集中在第一突跃点的寻找上。

因羧化程度、羧化位置以及羧甲基存在形式的不同，羧化后得到羧甲基壳聚糖其实是各种羧甲基壳聚糖的混合物[2-3]，根据壳聚糖上各基团的反应性分析，羧甲基取代的难易程度顺序为N位＞O位（由难到易）[4]。另据文献[5-6]报道，当用过量盐酸溶解羧甲基壳聚糖，采用电位滴定法用氢氧化钠滴定时，不同取代形成的第一突跃点对应的pH不同，故文献资料中选择pH 2.2下对应的体积作为V1的简化处理方式，在理论上是可行的。但是，这种处理方式是在假定羧甲基只以酸型或盐型中某一种型体存在，因此计算过程会产生一定的误差，不能真实反映过剩盐酸的含量，导致最终的取代度结果不准确，并带来了因取样量的差别而使结果无法重复的问题。

本文在《医用羧甲基壳聚糖》（YY/T 0953—2020）中附录B取代度测定方法的基础上进行了改进，引进了定量等体积的酸空白，扣除样品游离氨基和解离羧基净结合H+能力，消除样品固有游离结构带来的影响，可准确、重复的得到样品实际结合盐酸后过剩的体积。希望能够解决行业上采用滴定法测定羧甲基壳聚糖取代度时第一拐点无法准确、重复判断的问题。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

羧甲基壳聚糖，批号：20200113，爱美客技术发展股份有限公司；盐酸，药用辅料，分析纯，南京化学试剂有限公司；氯化钠，药用辅料，分析纯，天津海光药业有限公司；醋酸铵，分析纯，国药集团化学试剂有限公司；醋酸钠，三水合物，分析纯，国药集团化学试剂有限公司；氢氧化钠滴定液，0.1 mol/L，国家化学试剂质量监督检验中心。

1.2 仪器与设备

BSA224S-CW型电子天平，德国Sartorius公司；916 Ti-Touch型电位滴定仪，瑞士万通公司；RCT basic safety control型磁力搅拌器，德国IKA公司。

1.3 实验方法

1.3.1 溶液制备

1.3.1.1 溶剂

取盐酸、氯化钠，用水分别稀释后混合成0.1 mol/L盐酸溶液（含0.1 mol/L氯化钠）。

1.3.1.2 供试液

取样品约300 mg，精密称定，加溶剂30.0 mL使溶解，制成10 mg/mL溶液。

1.3.1.3 阳性对照液

取醋酸铵或醋酸钠约100 mg，精密称定，加溶剂30.0 mL使溶解，制成3.3 mg/mL溶液。

1.3.2 试验方法

取供试液，用0.1 mol/L氢氧化钠标准滴定溶液滴定，用电位滴定仪记录滴定液消耗的体积与pH值。另精密量取溶剂30.0 mL作为空白，按供试液滴定方法同法操作。按下述方法分别找出3个突跃点及其对应的滴定液消耗体积（mL）。

计算供试液的一阶微商（∆pH/∆V），以滴定溶液的消耗体积为横坐标，∆pH/∆V为纵坐标做图，得到一阶微商曲线；在pH值为3.5～10.0时，曲线的两个峰值即为第二、三突跃点，分别记录其对应的体积V2（mL）、V3（mL）。

按式（1）计算第一突跃点消耗的氢氧化钠标准滴定溶液的体积V1（mL）。

式中：VB0、VB2.2和VB2分别为空白在滴定终点时、pH=2.2时和V2对应pH点时所对应的滴定液消耗体积，mL；VY2.2和V2分别为供试液在pH=2.2和第二突跃点所对应的滴定液消耗体积，mL。

将上述确定的V1、V2、V3代入YY/T 0953—2020附录B中公式，计算样品的取代度[1]。

1.3.3 方法准确性

取阳性对照液进行滴定。一阶微商曲线制作方法同1.3.2，记录各阳性对照曲线的各个峰对应的pH及其消耗氢氧化钠的体积（VY1、V2），并在空白对照溶液中寻找这些pH点对应的空白消耗氢氧化钠体积（VB1、VB2）；另记录空白的等当点消耗氢氧化钠的体积（VB0）。

阳性样品中羧甲基含量和羧甲基的理论含量按式（2）和式（3）计算。

式中：59为羧甲基（CH3COO-）分子量；V1为过剩盐酸消耗的氢氧化钠体积[V1=VB0-（VB1-VY1）-（VB2-V2）]，mL；V2为第二突跃点消耗的氢氧化钠体积，mL；c为氢氧化钠标准滴定溶液的标定浓度，mol/L；m为样品称样量，mg；M为各阳性对照样品的分子量，醋酸铵为77，醋酸钠（三水合物）为136。

1.3.4 线性与范围

精密称定样品240～360 mg，共5份，按照1.3.2方法检测，计算样品的∆V1和∆V2；分别以∆V1、∆V2为纵坐标，样品的质量（W）为横坐标，进行线性回归。

1.3.5 重复性

取样品约300 mg，共6份，按照1.3.2方法检测。

2 结果与分析

2.1 准确性

如表1所示，醋酸铵和醋酸钠中检测的羧甲基含量与理论值偏差不超过5%，表明使用本方法测定羧甲基的原理基础具有一定的准确性。

表1 醋酸铵和醋酸钠中羧甲基含量检测结果的准确性

2.2 线性与范围

∆V1、∆V2与称样量的回归方程分别为y=0.038 8x+0.784 1，R=0.990 7；y=0.032 5x-0.016，R=0.994 4；在240.4～360.0 mg取样范围内，∆V1、∆V2与取样量的线性关系均良好（R＞0.99）。

2.3 重复性

由表2可知，6份羧甲基壳聚糖取代度的平均值为101.5%，RSD为4.3%，显示方法的重复性良好。

表2 羧甲基壳聚糖取代度检测重复性考察结果（n=6）

如图1和图2所示，典型的羧甲基壳聚糖取代度滴定曲线上可见第二和第三突跃点，但第一突跃点不明显，无法直接读取第一拐点值，若选择某一pH（如pH2.2）下对应的体积作为V1，计算过程会产生一定的误差，不能真实反映过剩盐酸的含量，因此采用

图1 典型取代度滴定过程图

图2 典型取代度一阶微商图

1.3.2 中式（1）计算第一突跃点消耗的氢氧化钠标准滴定溶液的体积。

3 讨论

本文深入分析了盐酸溶解样品和氢氧化钠滴定的离子化学过程。向样品中缓慢加入盐酸过程：当加盐酸至第二突跃点对应的pH（一般为3.6～5.3）时，样品中的所有解离羧基结合H+而成化合态，此时盐酸的加入量（V′），用消耗氢氧化钠滴定液的量表示，应为样品所有解离羧基结合盐酸的量；继续加盐酸至pH值为2.0～2.2时，样品的氨基和固有游离羧酸被转化成季铵盐的形式，此时盐酸的加入量（V′′），用消耗氢氧化钠滴定液的量表示，应为样品所有氨基的结合盐酸的量；继续加盐酸至过量，盐酸的加入量为V1；整个过程加入的盐酸总量（VB0），用消耗氢氧化钠滴定液的量表示，应为空白等当点的消耗。此处应有：VB0=V′+V′′+V1。

相反的，用氢氧化钠滴定盐酸溶盐的过程：在滴定到pH为2.0～2.2时，消耗的氢氧化钠为过剩盐酸和样品中固有游离羧酸贡献之和；继续滴定至第2突跃点（V2）时，消耗的氢氧化钠为结合盐酸的羧基贡献；继续滴定至第3突跃点（V3）时，消耗的氢氧化钠为结合盐酸的氨基贡献。此过程中，理论第一突跃点应在pH 2.2之前，消耗的氢氧化钠才恰为过剩盐酸贡献（即 V1）[7]。

因此可通过改进措施，采用加入定量过量的H+，分别滴定空白和样品，再在滴定曲线上找出VB0、VB2.2、VY2.2、VB2、V2；通过公式 VB0=V′+V′′+V1计算样品中净过剩盐酸的量V1[即V1=VB0-（VB2.2-VY2.2）-（VB2-V2）]，再按照《医用羧甲基壳聚糖》（YY/T 0953—2020）中附录B中的公式可计算出准确的取代度。

4 结论

文章建立了羧甲基壳聚糖取代度的检测方法，通过加入定量过量的盐酸，并引入空白对照，兼顾了样品的实际分子状态，提高了羧甲基壳聚糖取代度检测的准确性和重复性，解决了羧甲基壳聚糖取代度测定时长期困扰人们的难点，具有一定的推广应用价值。同时，本文根据文献[7]，选择了pH 2.2为第一个突跃点，在此基础上进行了滴定反应过程的分析，没有对不同取代位点的羧甲基壳聚糖进行深入的研究，还需要进一步探讨。