用于米酒酿造的酵母菌的研究进展

王乐惠， 张继宁， 周化岚， 张建国

上海理工大学 健康科学与工程学院 食品科学与工程研究所，上海 200093

米酒作为我国传统饮品，广受消费者喜爱。米酒是以糯米、黑米、籼米等作为原料，通过浸泡、蒸煮、糖化、微生物发酵等多步骤工艺酿造制得(图1)的传统饮品。米酒的酒精含量也可高达20%v/v。米酒不仅酸甜可口，而且含有活性生物肽、氨基酸、有机酸、维生素、多酚类、酯类等多种有益健康的成分(表1)，具有增强食欲、免疫力、有效地改善消化腺分泌的功能[1]，以及降血压及血脂[2]、舒缓疲劳、保护心脏的作用[3]。而且，王苗苗等还通过对羟自由基、氧自由基和DPPH自由基(1,1-diphenyl-2-picryl-hydrazyl)的抑制实验报道了米酒的抗氧化性[4]。米酒酿造过程酵母菌对米酒品质有重要影响。而且我国各地米酒的种类繁多，米酒中酵母菌种类各异。因此研究米酒中酵母菌的种类和作用效果对调控米酒工艺，提升米酒品质具有重要意义。本文综述了米酒中酵母菌，以及基于酵母菌的米酒品质和风味改善的应用。

表1 米酒中功能成分

图1 传统的米酒制备工艺示意图

2 米酒中酵母菌分析技术及主要菌株

酵母菌分离、形态学分析、生化测试和分子生物学鉴定是确定酵母菌菌株的主要步骤。从米酒发酵过程中分离酵母菌是开展研究的重要步骤。由于酵母可以在组成广泛的培养基上进行生长，因此从米酒发酵中分离酵母的培养基有麦芽提取物培养基、酵母培养基、葡萄糖-酵母提取物培养基等，并添加25 mg/L氯霉素[15]或土霉素(100 mg/L) 等抗生素筛选酵母菌。酵母菌通常在 pH 3.8～6.0 条件下生长，因此调整pH至更低值限制细菌生长[16]筛选酵母。添加联苯(50 mg/L)、乙醇(12%)、亚硫酸盐(0.015%) 选择性有利于酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)生长[17]。

根据形态学描述、生理生化测试仍是目前常用的微生物鉴定技术[18]。酵母的主要特征为椭球状或圆柱形细胞形状，在极端环境下产生假菌丝和光滑细胞壁。例如酵母菌受到环境胁迫由球形转变为短椭球状子囊孢子。目前已有商业化的酵母鉴定试剂，如法国BioMérieux 公司的API 20C 和ID 32C试剂盒、美国Biolog Inc.公司的Biolog YT试剂盒等。近年来，随着DNA测序技术的发展，随机扩增多态DNA分析、脉冲场凝胶电泳技术(PFGE)、指纹图谱等新技术已经用于分析酵母菌。随机扩增多态DNA方法利用随机引物扩增DNA片段，再进行可视化分析。PFGE分析酵母菌株染色体组成，完成酵母菌种鉴定。指纹图谱方法分析酵母基因组中随机存在重复的微卫星序列，鉴别酵母菌株。例如，酵母基因组的delta序列的数目和位置常用于区分酵母菌株[19]。与PFGE方法相比，delta序列指纹图谱在菌株水平的扩增模式具有偏好性。新型菌群分析技术，例如内源转录间隔区(Internally Transcribed Spacer，ITS)测序，还有待于应用于米酒酿造中酵母菌分析。ITS序列是位于真菌18S rRNA、5.8S rRNA和28S rRNA基因之间，分别为ITS1和ITS2。由于ITS承受自然选择压力较小，表现出极为广泛的序列多态性。并且ITS序列片段较小(ITS1和ITS 2长度分别为350 bp和400 bp)，易于分析，目前已被广泛用于真菌不同种属的系统发育分析。

表2总结了米酒中主要的酵母菌。虽然我国米酒产地的多样性，酵母菌数有所不同，但是总体上主要为酿酒酵母菌。

表2 米酒中鉴定的酵母菌

3 酵母菌株改造技术

酵母菌株改造主要通过同源重组(homologous recombination，HR)和非同源末端连接(non-homologous end-joining，NHEJ)两种方式修复已断裂酵母基因时插入，或者删去一段基因来改变酵母基因组。图2A为通过HR方式插入外源基因到酵母基因组的原理。外源基因通过两端的同源臂与酵母基因组中相对应的片段发生同源双交换，以“复制-粘贴”的方式安全(Generally recognized as safe，GRAS)且精确地插入到酵母基因组中。CRISPR/Cas (有规律间隔的聚类短回文重复及相关蛋白) 系统是一种全新的基因编辑技术，在2013年首次应用于酿酒酵母[31]。图2B为CRISPR/Cas系统用于酵母基因改造的原理。内切酶Cas被一小段RNA引导到匹配的基因序列后完成切割，产生双链断裂(Double strand break，DSB)[32-33]。酵母通过HR或NHEJ 途径修复时完成基因片段的插入或敲除。NHEJ方式在没有模板的情况下将双链断裂的酵母基因组连接起来，故NHEJ较易产生错误。HR和CRISPR在基因改造的精确性、无缝和无标记特点方面具有相互补充的作用。

(A: 同源重组；B: CRISPR技术)

双链断裂是酵母细胞交换基因所必需的步骤[34]。例如酿酒酵母的一种内切酶(HO-内切酶)能特异性切割基因组中交配型位点(Mating-type, MAT)，产生双链断裂[35]。缺失HO基因的酵母细胞的传代稳定，不易发生基因交换。这表明DNA双链断裂是配合型细胞的基因交换过程所必需的步骤。缺失HO基因的酵母突变体可作为稳定的单倍体菌株被用于基因改造。而且，酿酒酵母进行HR的同源臂可短至35 bp[36]。在酿酒酵母中重组表达HR的关键酶Rad51、Rad52显著提高HR效率[37-38]。相比用限制性内切酶进行克隆引入多余碱基的缺点，HR无需引入外来的限制性内切酶位点，实现无缝连接。HR可将25个长17 kb到26 kb的DNA片段在酿酒酵母中组装成支原体基因组[39-40]。该技术还被用于组装全合成的酿酒酵母基因组(酵母2.0)[41]。

为了避免在基因改造过程中使用抗性标记基因，研究人员开发了以URA3基因为筛选标记的重组酶诱导系统。基于URA3编码的蛋白质具有抗5′-氟乳酸功能，重组酶诱导系统通过基因重组或丢失质粒的方式，实现不采用抗性标记基因的方式[42]筛选突变菌株[43]。另外一种方法为基于噬菌体p1特异性的Cre-loxP重组系统。LoxP是一段Cre重组酶识别的34 bp序列[44]。Cre-loxP重组系统中在标记基因两侧分别整合loxP位点，完成重组后，Cre重组酶在酵母中表达并切割loxP位点，删除标记基因[45]。

4 基于酵母菌提升米酒酿造的进展

酵母菌在米酒酿造过程中不仅有生产乙醇的作用，还与其它微生物共同作用，对改进米酒酿造工艺、提高米酒品质有重要作用。

4.1 改进米酒酿造工艺

基于酵母菌株改进米酒酿造工艺的研究主要为两个方面。第一方面为采用外加酵母菌株改进酿造工艺。例如，杨建忠等利用干酵母延长黑米酒生产期，提高了出酒率，降低了发酵酸度，增强发酵力，防止杂菌感染，具有很好的经济效益和社会效益[46]。马玉麟采用耐高温活性干酵母改进豉香型米酒酿造工艺，豉香型米酒获得了国优等多个奖项[47]。第二个方面为多种微生物复配，改进米酒酿造工艺。颜兵优化了酿酒酵母和异常汉逊酵母的复配比例为100∶1时，乙酸乙酯含量提高了6.1倍；进一步优化得到以上2种酵母的最优酿造条件为31.2 ℃、发酵时间10.7 d、料液比80%(v/v)时，具有较高出酒率[48]。除酵母外，米酒中常见的微生物为霉菌，因此，目前与酵母复配的微生物主要为霉菌。例如，袁华伟等将酿酒酵母与米曲霉复配后，优化了酵母接种量、发酵温度、发酵时间，结果表明酵母接种量1.0%(以原料大米计)、25 ℃的13 d两步法发酵工艺显著提升了米酒的产率和质量[49]。卢福芝等将酵母菌与毛霉和酵母复配后发酵，得到最高乙醇产量为207 g/L，不仅酿造工艺更简单，而且米酒成分更丰富地包括醇、醛、酸及酯[26]。

4.2 提高米酒风味

酵母提高米酒风味的研究主要集中在米酒风味的判断和香味成分的鉴定。例如，袁华伟等将酿酒酵母和米曲霉进行复合后酿酒的米酒的乙醇含量为13.2%(v/v)。米酒呈现米黄色，具有水果香和花香，且感官评分为87.1分[49]。伍国明等利用酵母菌发酵郁南无核黄皮果和糯米，得到橙黄色、醇厚、甘甜爽口有独特风味的米酒[50]。王奇盛等优化了异常威克汉姆酵母(Wickerhamomycesanomalus)、扣囊复膜酵母(Saccharomycesfibuligera)和酿酒酵母三种酵母复配比例后，酿造米酒中高级醇含量下降了7.2%，米酒感官评分高达90.1分[51]。王奇盛等测定了上述三种酵母发酵米酒的风味物质，结果表明有机酸含量降低，酯类和醛类物质增加，感官评定表明米酒的口感与香气有着明显的提升[52]。郑瑞龙等筛选到1株具有优良香气特征的酿酒酵母NO.26。使用该菌株发酵米酒的香味物质含有苯乙醇(玫瑰、花香)、芳樟醇(薰衣草、花香)、十六酸乙酯(果香、奶油香)等挥发性风味化合物[53]。李泽洋等利用扣囊复膜酵母 11Z1发酵的米酒中包含醇类5种、酯类3种、酸类5种、酚类1种、酮类1种、烷烃类2种和其他类4种，共计21种风味物质。其中，乙酸乙酯、β-苯乙醇、乳酸乙酯的量分别提高了1.6、2.2和1.4倍[24]。车逸心等复配红曲菌和酵母后酿造的米酒中含有47种挥发性组分(6种醇类、14种酸类、12种酯类、8种醚类、4种醛酮类、2种醌类和1种酚类)[54]。由于用于米酒酿造的菌株、原料、工艺条件的不同，形成米酒风味的物质种类和含量都有显著差异。

5 展望

多种米酒的酵母菌已经被分离鉴定，而且也基于酵母改进了米酒酿造工艺，提升了米酒风味，说明酵母菌在米酒酿造的重要作用已经体现。但是，对米酒中酵母菌的研究仍有较大空间，主要体现在2个方面。首先，ITS测序等新型菌群分析技术应更广泛用于米酒酿造中酵母菌的鉴定。基于原位取样的ITS测序避免了培养酵母过程中菌株种类的改变，有利于发现更多的酵母菌种。其次，加强合成生物学技术的运用。目前酵母分子生物学技术不仅仅可以利用启动子工程、拷贝数、辅因子调节蛋白的改造，还可以进行组合途径的优化，代谢途径动态调控、合成基因组等工作，提升米酒的酿造工艺和品质。