外泌体在糖尿病肾脏疾病发病机制中的作用研究进展

白雨，刁宗礼，刘文虎

（首都医科大学附属北京友谊医院肾内科，北京 100050）

据统计，全球糖尿病患者超过4.15亿，预计2040年将增长至6.42亿[1]。近年来，我国糖尿病患病率逐年上升，约占全球糖尿病患者1/3[2]。糖尿病是一种复杂的异质性的糖代谢性疾病，主要表现为血糖升高，可出现多尿、多饮、疲劳、体质量减轻等典型症状，并可导致酮症酸中毒或非酮症高渗昏迷等急性并发症[3]，慢性高血糖还可引起多器官或组织功能失调，包括心血管疾病、肾脏损伤、视网膜病变、周围神经病变，皮肤损伤等[4]。其中，糖尿病肾脏疾病（DKD）是糖尿病最常见且最严重的慢性并发症之一，30%～40%的糖尿病患者会发生DKD，最终发展为终末期肾病（ESRD），增加患者心血管事件、感染、住院和死亡的风险[5]，降低患者生存率，加重社会经济负担[6]。DKD是以尿白蛋白排泄持续升高：尿白蛋白/肌酐比值（UACR）＞30 mg/g或估算肾小球滤过率（EGFR）持续降低：＜60 ml/（min·1.73 m²）为特征的糖尿病相关慢性肾脏病，其病理改变包括肾小球肥大、系膜区增宽、肾小球基底膜增厚、肾小管基底膜增厚及分裂、肾小球硬化、Kimmelstiel-Wilson结节形成、肾小管间质炎细胞浸润等[5]。目前，DKD的发病机制尚未完全明确[7]，需探寻其潜在治疗靶点。外泌体（exosomes）是细胞分泌的囊泡，内含有RNA、DNA、蛋白及脂类等多种生物活性物质，可被运输至其受体细胞并介导细胞间的通讯和信号传导[8]。研究[9]证实，肾脏中内皮细胞、足细胞、系膜细胞和肾小管上皮细胞、免疫细胞等在高糖环境的刺激下可诱导外泌体异常分泌。由此可见，在肾脏中，由高糖刺激下不同细胞分泌的外泌体介导的细胞间信号沟通在DKD发展和肾功能降低中发挥关键作用[10-11]。本文针对外泌体在DKD发病机制中的作用研究进展进行综述。

1 外泌体概述

1.1 外泌体的生成及调控 细胞外囊泡（EVs）是被脂质双分子层包裹的一些生物活性物质的小泡，可根据直径大小分为外泌体（直径40～150 nm），微泡（＞150～1 000 nm）和凋亡小体（＞1 000 nm），外泌体及微泡统称为非凋亡细胞外囊泡[12]。外泌体在分泌至细胞外前储存于多泡体（MVBs）内，随后形成晚期内体，最后与细胞膜融合后释放至细胞外[13]。外泌体的产生和分泌过程十分复杂，其具体机制尚未完全明确。目前已知转运所需的核内体分选复合体（ESCRT-III）形成螺旋，诱导囊泡出芽和分裂形成MVBs[14]，与病毒从宿主细胞内释放的方式相似[15]。而RAB11、RAB27A和RAB31等小GTP酶参与MVBs与细胞膜融合过程[16]。在p53蛋白的调控下，细胞骨架的激活可调控外泌体的胞吞和胞吐[17]。此外，神经酰胺的形成在外泌体的形成过程中发挥重要作用，对外泌体内的生物活性物质发挥修饰作用[18]。

1.2 外泌体的作用方式 外泌体从母细胞脱落后可通过两种方式发挥其生物学功能：一是与靶细胞表面的受体结合激活相应的信号通路发挥作用[19]；二是通过膜融合、内吞作用被受体细胞内化后通过其内含有的生物活性物质发挥多种生物学作用，如抑制凋亡[20]、促进炎症[21]等。外泌体具体作用与细胞来源、靶细胞及微环境密切相关，不同的微环境及细胞来源可使外泌体的表面标志物及内容物具有一定特异性，这些外泌体被靶细胞摄取后可能导致特异的表型及功能改变[22]。此外，外泌体的摄取过程也会受到细胞因子的影响，如巨噬细胞激活后可分泌胰岛素样生长因子-1（IGF-1），促进内皮细胞对外泌体的吞噬[23]。

1.3 外泌体在DKD中的作用 研究[1]表明，外泌体与DKD的诊断、发病机制及治疗关系密切。研究证实，糖尿病患者血清及尿液中外泌体与正常个体血清及尿液中外泌体存在差异，主要表现为外泌体中RNA水平差异，对外泌体RNA分析提示，miR-29c、miR-199-3p、miR-126、miR-770、miR-192、miR-126等可作为早期DKD潜在生物标志物[24-25]。在发病机制方面，肾脏中肾小球内皮细胞、足细胞、肾小管上皮细胞、系膜细胞、巨噬细胞等在病理状态下通过外泌体进行细胞间信号转导，造成靶细胞损伤，参与DKD的发生发展[26]。研究[27]发现，骨髓间充质干细胞（MSC）来源的外泌体可减轻高糖刺激的肾脏细胞及DKD动物模型的肾脏损伤，提示MSC来源的外泌体可作为DKD潜在治疗手段，但其具体作用机制仍需进一步探究[28-30]。

2 不同细胞来源的外泌体在DKD发生机制中的作用

2.1 巨噬细胞来源外泌体 研究证实，巨噬细胞在DKD的发生发展中起重要作用。肾脏损伤可募集并激活巨噬细胞，分泌细胞因子并与肾脏细胞相互作用。研究证实，巨噬细胞在高糖刺激下外泌体产生增加[31]。Zhu等[32]在体外用高糖刺激巨噬细胞产生的外泌体刺激肾小球系膜细胞，导致系膜细胞活化增殖，细胞外基质，如4型胶原（Col-IV）、纤连蛋白（FN）、α平滑肌肌动蛋白（α-SMA）和促炎细胞因子，如肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白介素-1β（IL-1β）、单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）分泌增加。向C57BL/6小鼠体内注射高糖刺激巨噬细胞产生的外泌体后，肾脏病理可见系膜扩张和增殖，免疫组织化学染色提示肾组织巨噬细胞浸润和系膜区细胞外基质沉积。研究发现，高糖刺激巨噬细胞产生的外泌体中转化生长因子β1（TGF-β1）和Smad3的mRNA水平较对照组显著升高，而用siRNA抑制巨噬细胞TGF-β1的表达后，外泌体中的TGF-β1水平降低，系膜细胞增殖验证反应减轻，提示高糖刺激巨噬细胞分泌的外泌体在体内和体外通过TGF-β1/Smad3途径激活肾小球系膜细胞[32]。Ding等[33]发现，在体外用高糖刺激后巨噬细胞分泌的外泌体刺激足细胞，可增加足细胞内活性氧产生和炎症激活。高糖刺激后巨噬细胞来源的外泌体内miRNA-21-5p的表达水平增高，降低足细胞中抗炎因子A20表达从而诱导足细胞损伤，这一机制在链脲佐菌素（STZ）诱导的糖尿病小鼠中也得到证实。高糖刺激巨噬细胞产生的外泌体不仅作用于足细胞、系膜细胞等肾脏细胞，还激活正常巨噬细胞产生炎症反应。Zhu等[31]发现，将高糖刺激巨噬细胞产生的外泌体加入正常巨噬细胞中使其激活并促进核转录因子（NF-κB）、TNF-α、IL-1β、诱导型一氧化氮合酶（iNOS）表达。将高糖刺激巨噬细胞产生外泌体经尾静脉注射至正常小鼠体内，可观察到小鼠肾脏明显的系膜扩张和增殖，肾组织NF-κB表达水平升高，提示高糖处理的巨噬细胞分泌的可能激活巨噬细胞，并通过NF-κB p65信号通路加速肾损伤。

2.2 肾小管来源外泌体 肾小管损伤在DKD的发生发展中占据重要地位。肾小管上皮细胞在受到高糖刺激后发生一系列病理改变，并与其他细胞相互作用，加重肾脏损伤[34-35]。研究[36]证实，高糖环境下肾小管来源的外泌体可对肾脏细胞产生影响。

Jia等[36]研究发现，高糖刺激肾小管上皮细胞HK-2后产生的外泌体刺激正常的肾小管上皮细胞会导致其纤维化改变。而用长效胰高血糖素样肽1（GLP-1）类似物艾塞那肽（Exendin-4）预处理高糖刺激的HK-2细胞后产生的外泌体刺激正常肾小管上皮细胞，可减少FN和1型胶原（Col-I）分泌，且Exendin-4可通过p53依赖方式降低HK-2细胞及外泌体内miR-192，改善纤维化改变，该实验结果提示Exendin-4可通过抑制肾小管上皮细胞分泌miR-192改善高糖诱导纤维化。王东等[37]用高糖刺激肾小管上皮细胞，收集肾小管上皮细胞来源的外泌体，与巨噬细胞共培养后发现，高糖环境下肾小管上皮细胞分泌的外泌体可通过丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）/NF-κB信号通路诱导巨噬细胞激活和功能改变。Hu等[38]发现，高糖联合醛固酮刺激肾小管上皮细胞HK-2产生的外泌体与肾脏肾纤维细胞共培养可加重成纤维细胞的激活和纤维化，miRNA测序发现，高糖联合醛固酮刺激后HK-2细胞产生的外泌体中miR-196b-5p水平显著增加，进一步研究发现，miR-196b-5p可抑制细胞因子信号转导抑制因子2（SOCS2）表达并增强转录激活因子3（STAT3）磷酸化，促进成纤维细胞功能异常及纤维化。该研究还发现，DKD患者的血浆miR-196b-5p水平高于非DKD患者，并与蛋白尿浓度呈正相关。与非DKD患者相比，糖尿病患者的肾脏标本中，主要位于肾小管上皮细胞的miR-196b-5p的表达增加。该研究提示肾小管上皮细胞外泌体来源的miR-196b-5p在DKD纤维化中发挥重要作用。Wen等[39]发现，在体外用高糖刺激肾小管上皮细胞产生的外泌体刺激成纤维细胞NRK-49F可导致其增殖、形态学改变和FN、α-SMA和Col-I大量产生。该研究对外泌体进行蛋白质组学分析发现，与正常外泌体相比，高糖刺激后肾小管上皮细胞产生的外泌体有22个差异表达蛋白，生物信息学分析提示，蛋白烯醇酶1（Eno1）的表达与DKD密切相关。该研究提示高糖刺激肾小管上皮细胞产生的外泌体可促进纤维化，与Hu等[38]研究结果一致。

Rab27a是调节外泌体分泌的关键因子[40]，抑制Rab27a的表达可使细胞外泌体的分泌减少50%～70%[22]。此外，Rab27a敲除可改善小鼠的炎症反应[41]。Li等[42]发现，高脂饮食联合STZ诱导DKD小鼠肾组织和BSA刺激的HK-2细胞中，Rab27a、IL-6、TNF-α和COL-I的表达显著增加。体外抑制Rab27a表达可减轻HK-2细胞的炎症反应，进一步研究发现，抑制Rab27a可减少肾小管上皮细胞富含miR-26a-5p的外泌体分泌，提高细胞内miR-26a-5p浓度，并通过抑制阳离子转运调控样蛋白1（CHAC1）/NF-kB通路减轻DKD炎症反应[42]。

上述研究证实，高糖刺激肾小管细胞可增加外泌体分泌，并通过被靶细胞内化，促进肾间质炎症反应和纤维化，提示阻断高糖环境下肾小管细胞外泌体的分泌及探究外泌体发挥损伤的作用机制，可为寻找DKD治疗的靶点提供理论基础。

2.3 系膜细胞来源外泌体 DKD的病理改变包括细胞外基质分泌过多及肾小球系膜扩张，逐渐扩张的系膜堵塞肾小球毛细血管导致肾小球组织完整性和肾功能受损，最终加剧肾小球纤维化和瘢痕形成[43]。Wang等[44]发现，高糖刺激肾小球系膜细胞产生的外泌体可导致足细胞损伤，且高糖刺激后，肾小球系膜细胞分泌的外泌体中TGF-β1表达水平较对照组显著增加，进一步研究证实，肾小球系膜细胞来源外泌体通过TGF-β1/磷脂酰肌醇（PI3KAKT）通路导致足细胞损伤，而小檗碱预处理足细胞可减轻上述损伤。Tsai等[45]发现，db/db小鼠及2型糖尿病患者尿液中分离的外泌体miR-15b-5p水平升高，且与UACR水平正相关，同样，体外高糖刺激肾小球系膜细胞后miR-15b-5p水平升高，而miR-15b-5p可通过降低其靶蛋白BCL-2表达水平诱导系膜细胞凋亡，但该实验未进一步提取系膜细胞来源外泌体进行成分分析及其对靶细胞的影响。

2.4 内皮细胞来源外泌体 肾小球内皮细胞功能障碍是DKD发生最早的病理改变，可能通过旁分泌作用导致其他肾脏细胞损伤[46]。外泌体是内皮细胞与肾脏其他细胞沟通的介质。Wu等[47]发现，高糖刺激肾小球系膜细胞后外泌体分泌增多，这些外泌体可被足细胞内化，导致足细胞发生上皮间充质转分化和屏障功能障碍，进一步研究发现，在高糖刺激肾小球系膜细胞分泌的外泌体中，TGF-β1和Wnt/βcatenin水平较对照组显著增加，提示TGF-β1和Wnt/β-catenin可能与足细胞功能障碍相关。Wu等[48]研究还发现，高糖刺激肾小球系膜细胞分泌的外泌体可通过TGF-β1/Smad3信号通路促进肾小球系膜细胞中α-SMA表达、增殖和细胞外基质蛋白分泌，提示高糖环境下肾小球内皮细胞来源的外泌体可激活肾小球膜细胞并促进肾脏纤维化。

2.5 足细胞来源外泌体 足细胞损伤是DKD的典型病理改变之一，在DKD的发生发展中占据重要地位。Munkonda等[49]研究证实，损伤的足细胞产生的外泌体可通过p38 MAPK和CD36途径刺激肾小管上皮细胞转分化，提示足细胞来源的外泌体会作用于肾小管上皮细胞发生相应的病理变化。Su等[50]发现，高糖刺激足细胞后产生的外泌体可使肾小管上皮细胞发生转分化。高糖刺激足细胞来源的外泌体内miR-221表达显著增加，miR-221的靶蛋白Dickkopf相关蛋白2（DKK2）是Wnt信号通路抑制剂，miR-221表达升高可引起Wnt/β-catenin通路水平升高，促进肾小管上皮转分化。抑制miR-221可降低肾小管上皮细胞内Wnt/β-catenin表达水平，减轻细胞损伤。该研究提示高糖刺激后足细胞来源的外泌体通过microRNA-221介导DKD肾小管细胞的转分化。

3 小结

DKD是糖尿病最常见的微血管并发症之一，在临床中DKD患者肾活检中发现的最经典的病理改变为弥漫性和结节性系膜扩张和肾小球基底膜增厚[51]。同时，肾小管间质病变也参与疾病的发展，包括肾小管萎缩、间质炎症和肾小管间质纤维化[35]，与肾功能丧失密切相关。因此，肾小球内皮损伤、足细胞损伤、系膜细胞功能异常和肾小管间质损伤等病理过程在DKD的发生发展中发挥重要作用。

在糖尿病环境下，肾脏细胞间的相互作用机制尚未明确。外泌体是细胞间沟通的重要途径，探究细胞间外泌体的信号传递对研究DKD的发病机制具有重要意义。目前外泌体在DKD发生机制中的研究多与肾小管上皮细胞及巨噬细胞相关，提示高糖或蛋白刺激后肾小管上皮细胞或巨噬细胞来源的外泌体会加重肾脏损伤，而内皮细胞、足细胞及系膜细胞相关的研究较少，需进一步实验探究外泌体在糖尿病肾小球病变中的作用。此外，目前大部分研究为体外实验，证实高糖刺激后肾脏细胞外泌体发挥的作用，需进行相应的在体实验以深入探究不同细胞来源的外泌体在DKD发病机制中的作用。