急性胰腺炎患者血清微小RNA-340-3p、CXC趋化因子配体-13和CXC趋化因子配体-16的表达意义

刘 伟，支 媛，高 璐，滕 萱，陆 双

(锦州医科大学附属第一医院产科，辽宁 锦州 121000)

急性胰腺炎的发病率及病死率逐年升高，轻型急性胰腺炎预后较好，而重型急性胰腺炎病情重，病变常进展迅速，可合并多器官功能障碍、脓毒症等危及生命的并发症[1-2]。早期诊断及干预是防止急性胰腺炎病情加重的关键。近年学者关注到血清中的相关因子与病变的形成和进展相关。CXC趋化因子配体13(CXCL-13)、CXC趋化因子配体16(CXCL-16)属于趋化因子家族，由次级淋巴器官中的滤泡树突细胞和组织细胞产生，能与表达在B淋巴细胞、T淋巴细胞及滤泡树突细胞表面的CXCR-5相结合，引起B淋巴细胞及T淋巴细胞在炎性区域聚集，促进淋巴滤泡的形成[3]。近年学者研究发现两者在炎性疾病的形成中具有一定作用[4-5]。微小RNA(microRNAs,miRNAs)是学者在研究中发现的能调控炎性疾病形成的因子，主要是对下游靶基因进行调控发挥生物学作用[6]。微小RNA-340-3p(miR-340-3p)是一种与炎性反应和肿瘤增殖相关的多功能miRNA，其下游因子较多，也是其功能复杂的重要因素[7]。在生物信息预测时本课题组发现miR-340-3p均与CXCL-13、CXCL-16有可结合的位点。本研究检测急性胰腺炎患者血清中miR-340-3p、CXCL-13和CXCL-16的表达特征，分析其相关性及在病变进展中的价值，以期为临床工作提供帮助。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选择2021年8月至2022年6月于我院明确诊断为急性胰腺炎69例作为观察对象。病例纳入均符合《中国急性胰腺炎诊治指南(2019)》中的标准，即符合下述3项中2项：①符合急性胰腺炎腹痛特征；②血清淀粉酶和(或)脂肪酶浓度上调至3倍及以上；③腹部影像学表现支持。患者均为首次发病，24 h内入院就诊。排除标准：慢性胰腺炎、自身免疫性疾病史、恶性肿瘤史、合并严重的高血压及肝肾功能不全者。本研究经伦理委员会批准，家属均签署知情同意书。依据2012年亚特兰大的标准进行分级。轻症：无坏死及器官功能障碍；中重症：一过性器官功能障碍，或伴有局部或全身并发症；重型：持续性(>48 h)器官功能障碍伴感染性胰腺坏死。

1.2 检测方法 患者确诊后抽取3 ml空腹静脉血后，离心(3000 r/min)20 min后，将血清分离，并置于-80 ℃冰箱中冻存。样本集中检测，由同一检验师操作，并均于1个月内完成。

1.2.1 qRT-PCR检测miR-340-3p ：应用实时荧光定量PCR法(qRT-PCR法)检测miR-340-3p的表达。TriZol提取总RNA(TriZol购于美国invitrogen)。应用逆转录合成cDNA，引物由上海通生工公司合成，miR-340-3p上游：5’-ACTGCTGCTGTGTGGTGAC-GTACG-3’，下游：5’-GCACGTGCGCACGTCGTGTTATT-3’。以U6作为内参，引物上游：5’-GGCA-GAAACGTGGAACCG-3’下游：5’-TTGGAACAGT-GGGCAAATTC-3’。扩增程序：95 ℃ 5 min；95 ℃ 25 s，64 ℃ 20 s，72 ℃ 20 s；延伸。以2-ΔΔCt法表示结果。

1.2.2 CXCL-13和CXCL-16的检测：应用酶联免疫吸附实验(ELISA)检测血清中CXCL-13和CXCL-16的表达。CXCL-13(ab269370)和CXCL-16(ab197744)均购自英国Abcam公司。取出冻存血清，自然融化后，轻轻振荡混匀，加入100 μl标准品、样品和对照品，贴上封板膜，37 ℃孵育90 min后进行洗涤，加入100 μl工作液，孵育60 min，洗涤后加入100 μl ABC工作液，37 ℃孵育30 min，PBS洗涤5次，加90 μl TMN显色剂，37 ℃孵育2 min后，每孔加入准备好的TMN stop solution，颜色立刻变为黄色，应用酶标仪式检测(450/546 nm双波长)，测定各孔OD值。以标准品浓度为横坐标，OD值为纵坐标，制作标准曲线，计算其余各孔样本浓度。

2 结 果

2.1 两组一般资料比较 收集病例中男35例，女34例，有吸烟史者为19例，无吸烟史者为50例；年龄30～75岁，平均(50.53±5.37)岁，体重指数(BMI)范围17.1～32.2 kg/m2，平均(23.61±2.56)kg/m2。对照组中男33例，女36例，有吸烟史者为15例，无吸烟史者为54例；年龄27～60岁，平均(47.09±5.35)岁，BMI范围18～29 kg/m2，平均(22.21±1.52) kg/m2。两组在常规资料比较中差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 两组一般资料比较

2.2 两组miR-340-3p、CXCL-13和CXCL-16表达比较 两组miR-340-3p、CXCL-13和CXCL-16的表达差别有统计学意义(P<0.05)，即观察组中miR-340-3p的表达下调，CXCL-13和CXCL-16的表达升高。见表2。

表2 两组中miR-340-3p、CXCL-13和CXCL-16表达比较

2.3 观察组不同临床特征中miR-340-3p、CXCL-13和CXCL-16表达的差异 miR-340-3p、CXCL-13和CXCL-16在观察组不同病变分级的表达中差异有统计学意义(P<0.05)，miR-340-3p、CXCL-13和CXCL-16在不同性别、年龄、BMI及有无吸烟史的表达量差异无统计学意义(P>0.05)。见表3。

表3 观察组不同临床特征中miR-340-3p、CXCL-13和CXCL-16表达的差异

2.4 观察组中miR-340-3p、CXCL-13和CXCL-16的相关性 应用Pearson相关分析显示，观察组中miR-340-3p和CXCL-13(r=-0.634,P=0.032)、miR-340-3p和CXCL-16(r=-0.620,P=0.022)均呈负相关性，CXCL-13和CXCL-16(r=0.614,P=0.014)呈正相关性。

2.5 生物信息分析 先利用miRNAs靶基因预测网站Targetscan Human 7.2(http://www.targetscan.ort/vert_72)进行预测，筛选出miR-340-3p的全部靶基因。将全部靶基因输入DAVID 6.8(Database for Annotation,Visualization and Integrated Discovery)的生物信息分析网站(https://david.ncifcrf.gro/home.jsp)，用GO生物学功能富集分析及KEGG信号通路分析，筛选相关的靶基因。将两组靶基因输入Venny2.1(http://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)，找到交集基因。结果显示miR-340-3p与CXCL-13、miR-340-3p与CXCL-16有可能结合的位点。

3 讨 论

急性胰腺炎的发生是多种生物学因子参与的疾病，多种研究显示其发生有炎性调控机制、遗传机制及免疫性机制等[7-8]。趋化因子是与炎性调控相关的一组细胞因子，是一类对靶细胞有趋化作用的细胞因子，能与表达靶基因的细胞膜上的相应受体结合，促进靶细胞的迁移而表现出特异的生物学效应[9-10]。CXCL-13基因定位于4q21上，其氨基酸序列与小鼠有约2/3的同源性，在人体主要分布在肝、脾、淋巴结和胃中[11]。CXCL-16在人体主要分布在肺、肝、小肠及肾脏，两者主要表达在单核巨噬细胞、树突状细胞、内皮细胞，均包含跨膜区和黏蛋白样结构，具有分泌型和结合型两种形式。CXCL-13、CXCL-16在人正常胰腺组织中的表达量极低[12-13]。也有研究认为急性胰腺炎病变形成时细胞因子的表达量增加，是炎性反应的瀑布效应结果，其中有关的信号因子较多，也包括miRNA的靶向调控作用调节因子[14-15]。miRNA是复杂的信号调控网络的重要部分，其经典方式是作为上游因子对下下游靶基因进行调控而发挥生物学特性[16]。miRNA发生改变时，下游多种因子也发生改变这能使mRNA 的翻译功能发生改变[17]。本实验筛选出的miR-340-3p具有调控炎症及肿瘤细胞增殖的多重作用。

本研究结果显示miR-340-3p在急性胰腺炎患者血清中的表达量明显降低，CXCL-13和CXCL-16的表达量明显增高，提示miR-340-3p、CXCL-13和CXCL-16的异常表达状态是急性胰腺炎病变形成过程中的重要分子事件。结果显示miR-340-3p、CXCL-13和CXCL-16在急性胰腺炎的不同病变分级中的表达差异有统计学意义，即miR-340-3p在重症患者的表达量更低，CXCL-13和CXCL-16在重症患者表达更高，提示miR-340-3p、CXCL-13和CXCL-16与病变分级程度密切相关，也提示检测三者的表达可能与病变分级相关，可能是预测病变分级的客观指标。结果显示miR-340-3p与CXCL-13、miR-340-3p与CXCL-16均具有负相关性，且经生物信息预测并发现有相关结合位点，提示其具有负向协同作用。活化后的CXCL-13对胰腺上皮细胞及间质细胞的损伤有明显的促进作用。有研究认为CXCL-16表达升高，能促进细胞内炎性小体的表达，使其活性增强；也有学者发现CXCL-16的表达增加常伴随着氧自由基的产生，使局部组织和细胞发生损伤[18]。有学者探究手术后脑膜炎患者脑脊液中CXCL-13的水平，发现CXCL-13在术后并发脑膜炎患者脑脊液中水平明显升高，认为其不仅影响脑膜炎的进程，还对于筛查术后并发脑膜炎患者有一定价值[19]。miR-340-3p下降在机体中的作用途径可能更多，如调节白细胞的“胞吞”作用、减弱巨噬细胞的活化等，使损伤因子的清除能力增强[20]。也有研究认为miR-340-3p的效应因子是长非编码RNA 反义RNA，因此基于miR-340-3p在炎症中进行深入研究对探讨炎症形成的分子机制可能有重要价值。急性胰腺炎在疾病发展时细胞和组织形成多种炎性细胞因子[21]，部分因子如IL-18等能通过NO依赖途径加速表面上皮的损伤，并引起纤维细胞等间质细胞成分的改变。但是miR-340-3p与CXCL-13、miR-340-3p与CXCL-16的具体靶向调控作用尚需要体外行双荧光素酶等基础实验进一步证实。

总之，急性胰腺炎患者血清中miR-340-3p低表达、CXCL-13和CXCL-16高表达，miR-340-3p与CXCL-13、miR-340-3p与CXCL-16具有负向协同作用，参与病变的形成和进展。