顶空-固相微萃取和同时蒸馏萃取法提取肉桂的挥发性成分

詹思佳，苏蔚莹，王道梁，陈文嵩，兰晓晔，孙雅倩，刘志彬，倪莉

（福州大学食品科学技术研究所 福建省食品生物技术创新技术研究中心 福州 350108）

武夷岩茶属于半发酵茶，是乌龙茶的典型代表。它可细分为肉桂、水仙、大红袍、白鸡冠等。其中，肉桂是武夷岩茶的主要品种，其风味特征是香气馥郁清长，带乳香或桂皮香或花果香[1-2]。

武夷肉桂的香气是评价其品质优、劣的重要指标。挥发性成分的萃取是分析茶叶香气成分核心环节。常用的挥发性成分萃取方法有同时蒸馏萃取法（Simultaneous Distillation Extraction，SDE）、减压蒸馏萃取（Vacuum Distillation Extraction，VDE）、搅拌棒吸附萃取（Stir Bar Sorptive Extraction，SBSE）、溶剂辅助香气萃取（Solvent Assisted Flavor Evaporation，SAFE）、超临界流体萃取（Supercritical Fluid Extraction，SFE）、顶空固相微萃取法（Head Space Solid Phase Microextraction，HS-SPME）等[3-4]。其中，HS-SPME 和SDE 是目前应用最广泛的挥发性成分萃取方法。张丽等[5]采用HS-SPME 萃取武夷岩茶的挥发性成分，结果表明该茶中醇类、含氮化合物和醛类所占比例较大。Liao 等[6]采用HS-SPME 萃取“烤玉米”香型绿茶的挥发性成分，其主要为醇类、醛类和酯类，同时发现HS-SPME 法所捕集到的主要是易挥发及中等挥发性的成分。周春娟等[7]发现SDE 法提取的凤凰单枞茶的挥发性成分以醇类、烷烃、萜烯等高沸点的挥发性成分居多。Song 等[8]比较了SDE 法和VDE 对南非红叶茶挥发性成分的影响，结果表明：SDE 法可以有效萃取低挥发性和高分子量的成分。不同的挥发性成分提取方法各有优、缺点。HS-SPME 法是一种集样品采集、萃取、浓缩、进样、解析为一体的萃取方法，操作简便、快速，不需要添加溶剂，能够体现样品的真实香气，然而，HS-SPME 不利于萃取挥发性弱的成分，同时其提取效率与试验条件的选取密切相关[3，9-10]。SDE 法将蒸馏与萃取合二为一，通过反复的萃取浓缩得到挥发性成分，然而，长时间的高温萃取易导致样品香气失真[11]。目前的研究大多采用单一的挥发性成分提取方法，而单独使用SDE 或HS-SPME 可能无法充分反映肉桂茶的香气成分。

为了充分提取肉桂茶的挥发性成分，获得较为完整的香气组分轮廓，本文采用HS-SPME 和SDE 两种方法萃取肉桂茶的挥发性成分，并对HS-SPME 的萃取条件，包括萃取纤维材料、萃取时间和温度、盐添加量进行优化，为肉桂茶特征香气成分的研究提高参考数据。

1 材料与方法

1.1 材料

茶叶样品，福建省公泰茶叶有限公司武夷山制茶厂提供。氯化钠、无水硫酸钠、乙醚（分析纯），国药基团化学试剂有限公司。

1.2 主要仪器与设备

7890-B/5977A 气相色谱-质谱联用仪（GCMS），美国Agilent 公司；手动固相微萃取装置和固相微萃取头（含有50/30 μm CAR/DVB/PDMS、100 μm PDMS、65 μm PDMS/DVB 和75 μm CAR/DVB/PDMS 萃取头），美国Supelco 公司；BL150 电子天平，德国赛多利斯公司；DC-12 氮吹仪，上海安谱科学仪器有限公司；DF-1 集热式磁力搅拌器，金坛市鑫渃实验仪器厂；同时蒸馏萃取装置，福州科翰实验仪器贸易有限公司；QYSW-10B 超纯水机，重庆前沿水处理设备有限公司；电热套；HH-1 数字恒温水浴锅，常州普天仪器制造有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 茶香气的萃取

1.3.1.1 顶空-固相微萃取条件优化 称取0.1 g茶粉、5 mL 沸腾去离子水与磁力转子一同置于15 mL 顶空瓶中，浸提5 min。使用SPME 萃取样品中的挥发性成分，比较4 种纤维头（100 μm PDMS、65 μm PDMS/DVB、75 μm CAR/PDMS 和50/30 μm DVB/CAR/PDMS）、5 个萃取温度（40，50，60，70，80 ℃）、5 个萃取时间（30，40，45，50，60 min）和5 个盐添加量（10%，20%，30%，40%，50%）对挥发性成分的提取效果。SPME 在GC-MS 上的解吸附条件为250 ℃，5 min。

1.3.1.2 同时蒸馏萃取 依照文献[11]报道的优化的同时蒸馏萃取条件提取武夷肉桂的挥发性成分。得到的萃取液经氮气浓缩除去大部分乙醚溶剂至1 mL，移入棕色小瓶中密封，于-20 ℃冰箱保存，待GC-MS 分析。

1.3.2 GC-MS 分析条件 色谱条件：色谱柱HPINNOWAX 毛细管柱（30 m × 0.25 μm ×0.25 mm）；升温程序：初始温度40 ℃，保持5 min，以5 ℃/min 升至120 ℃，再以10 ℃/min 升至240 ℃，保留5 min；后运行温度240 ℃，后运行时间5 min；进样口温度250 ℃；进样方式：不分流进样。载气为高纯He，纯度99.999%。

质谱条件：离子源温度230 ℃；四级杆温度150 ℃；扫描模式：全扫描；质量扫描范围：m/z 35-450。

1.4 数据分析

结合NIST11 谱库检索和保留指数RI，根据参考文献[12]，[13]共同定性。挥发性成分定量采用面积归一化法。

2 结果与讨论

2.1 优化的顶空-固相微萃取条件

2.1.1 萃取纤维 选择合适的萃取纤维对茶香气的萃取非常重要。萃取纤维是基于挥发性成分在涂有极性或非极性固定性薄层的熔融石英纤维上吸附和解吸，PDMS 为非极性萃取头，主要吸附非极性挥发性成分；CAR/PDMS 和PDMS/DVB 具有双极性特性；DVB/CAR/PDMS 包含3 种涂层，主要吸附C3～C20 挥发性和半挥发性成分[14]。本试验对4 种常见的萃取纤维（DVB/CAR/PDMS、CAR/PDMS、PMDS/DVB 和PDMS）在50 ℃下萃取45 min，并添加40% NaCl，进行比较分析，结果见图1。不同萃取纤维所得挥发性成分的总量（总峰面积）有显著差异（P＜0.05）。其中，DVB/CAR/PDMS 纤维所萃取的挥发性成分总峰面积和数量最多，而PDMS 最少，可能是因为DVB/CAR/PDMS是一种具极性和非极性复合涂层的萃取纤维，它对挥发性成分的萃取效果最好。同时，这4 种常见的萃取纤维对不同种类挥发性成分的萃取也存在较大的差异（图2）。CAR/PDMS/DVB 对醇类、酚类、呋喃类、含氮化合物、酮类和酯类的萃取效果好，CAR/PDMS 对含氮化合物和烃类萃取效果好，PMDS/DVB 适合萃取酯类成分。综上，CAR/PDMS/DVB 对武夷肉桂挥发性成分的萃取效果最好。

图1 萃取纤维对总峰面积（a）和峰数（b）的影响Fig.1 Effect of fibers on total peak area and total peak number

图2 萃取纤维对不同挥发性成分类别的影响Fig.2 Effect of fibers on the classes of volatile components

2.1.2 萃取温度 在确定最佳萃取纤维材料（CAR/PDMS/DVB）后，探究萃取温度（40，50，60，70，80 ℃）对肉桂挥发性成分的影响，结果如图3所示。当萃取温度为50 ℃时，挥发性成分的总峰面积和数量达到峰值，随后，随着温度的上升，挥发性成分的总峰面积显著下降。提高萃取温度有利于加速挥发性成分的扩散速率，而HS-SPME过高的萃取温度会降低其的分配系数，导致挥发性成分的萃取效率降低[15]。综上，选择50 ℃作为最佳的萃取温度。

图3 萃取温度对总峰面积（a）和峰数（b）的影响Fig.3 Effect of extraction temperature on total peak area and total peak number

2.1.3 萃取时间 萃取纤维需暴露在顶空一段时间，以萃取茶叶中的挥发性成分。探究5 个萃取时间（30，40，45，50，60 min）对挥发性成分的影响。结果表明，挥发性成分的总峰面积和数量随着萃取时间的延长而显著增加，在60 min 时显著降低（图4）。这一变化趋势与Du 等[14]的研究结果一致，HS-SPME 的萃取时间在低于60 min 时，挥发性成分总峰面积显著上升，而高于60 min 时显著降低。样品萃取时间过短，顶空、萃取纤维和茶汤之间无法达到平衡；萃取时间过长，会引起挥发性成分在萃取纤维吸附相上发生位点竞争，导致香气成分总量降低[16]。选择最佳萃取时间50 min。

图4 萃取时间对总峰面积（a）和峰数（b）的影响Fig.4 Effect of extraction times on total peak area and total peak number

2.1.4 盐添加量 选择加盐量10%，20%，30%，40%，50%，研究盐添加量对挥发性成分的影响。茶叶萃取过程中加盐有利于降低挥发性成分的水溶性，促进扩散速率，结果见图5。挥发性成分的总峰面积在统计学上无显著差异。当盐添加量为20%时，收集的挥发性成分种类最多。这可能是因为盐含量过高，存在溶液黏度增大的风险，导致萃取效率降低[17]。选取最佳盐添加量20%。

图5 盐添加量对总峰面积（a）和峰数（b）的影响Fig.5 Effect of salt contents on total peak area and total peak number

2.2 HS-SPME 和SDE 两种提取方法所得挥发性成分

采用优化后的HS-SPME 条件和文献报道的SDE 条件[11]提取武夷肉桂挥发性成分，采用GCMS 进行定性、定量分析，所得总离子流图见图6。采用两种萃取方法共鉴定出93 种挥发性成分，各成分的定性与定量结果见表1。其中，采用HSSPME 法共鉴定出84 种挥发性成分，SDE 法为40种。两种方法共同检出的成分有26 种。综合两种提取方法可知，武夷肉桂中的主要的挥发性成分有杂环类化合物、醇类、烯烃类和酯类等。两种方法对这些物质的萃取效率有一定差异。

图6 HS-SPME（a）与SDE（b）提取武夷肉桂茶挥发性成分总离子流图Fig.6 Total ion current chromatograms of volatile compounds from Wuyi rougui extracted by HS-SPME and SDE

杂环类化合物，如吡嗪、吡咯、吲哚、呋喃等[18]，主要是茶叶在加工过程中发生美拉德反应而形成的香气成分。从表1 可知，2-甲基吡嗪、2-乙基吡嗪、2，5-二甲基吡嗪、2，6-二甲基吡嗪、2-乙基-5-甲基吡嗪和吲哚在两种提取方法中均有检出。吡嗪、吡咯和呋喃是美拉德反应形成的关键产物，其中吡嗪是具有强烈的焙烤香、坚果香的挥发性成分，并且有较低的感官阈值[19]。吲哚也是乌龙茶的重要香气成分，在低浓度下呈现浓郁的花香。对比两种提取方法发现，HS-SMPE 对吡嗪、吡咯和呋喃的提取效率更高，例如用HS-SPME 法所得2，5-二甲基吡嗪含量为1.39%，而SDE 法为0.60%；HS-SPME 法检出茶吡咯为15.13%，而SDE 法中未被检出；在HS-SPME 法得到的糠醛含量为2.22%，而SDE 法为1.39%。然而，SDE 有利于吲哚的萃取，其含量为1.24%，而HS-SPME法仅为0.47%。

表1 经HS-SPME 和SDE 萃取后武夷肉桂的挥发性成分Table 1 The volatile compounds of Wuyi rougui by HS-SPME and SDE

（续表1）

（续表1）

醇类在肉桂中所占比例较大，仅次于杂环类化合物。其中芳樟醇、苯甲醇、苯乙醇和橙花叔醇在两种提取方式下均有检出。芳樟醇是茶叶中呈现花香的萜烯醇类。在磷酸甲基赤藓糖醇途径中生成的香叶焦磷酸是生成芳樟醇的重要前体物质[20]。苯甲醇和苯乙醇是茶叶中呈现“果香”的重要成分，可以通过苯丙氨酸转化形成[21]。橙花叔醇具有玫瑰、水果香气，是衡量肉桂品质的重要香气成分。两种提取方法对醇类的提取效率存在很大的差异，HS-SPME 法适合提取中、低沸点的脂肪族醇类，如己醇、反-3-己烯醇、庚醇和1-辛烯-3-醇等，它们在SDE 法均未检出，可能因为SDE 法的长时间高温萃取导致中、低沸点脂肪族醇类的损失。SDE 法有利于提取挥发性较低的醇类，如叶醇和异植醇，它们仅在SDE 法中被检出，主要呈现清香和花香，然而，它们的气味阈值高不易被感知，虽然含量较高，但是这两种化合物的挥发性较低[14，22]，对武夷肉桂的香气贡献不大。

烯烃类也是构成武夷肉桂挥发性成分的重要一部分。王鹏杰等[23]发现武夷岩茶香气成分以醇、烯、酯类化合物居多，橙花叔醇、α-法尼烯、吲哚、（Z）-己酸-3-己烯酯是岩茶的特征香气成分。两种提取方法均检出α-法尼烯、对二甲苯。α-法尼烯主要呈花香，可通过类胡萝卜素非酶促氧化而形成[24]，其在HS-SPME 和SDE 法的含量分别为0.48%和1.07%，是武夷肉桂较为重要的香气成分。HSSPME 法检出对二甲苯为4.52%，SDE 法仅为0.16%。

酯类通常被认为是茶叶中一类具有花果香特征的香气成分，是肉桂重要的一类挥发性成分。2-糠酸甲酯、己酸己酯、水杨酸甲酯和棕榈酸甲酯在两种提取方法中均有检出，仅含量存在差异。如2-糠酸甲酯在茶叶中主要呈现焦糖香，它在SDE法的含量为1.60%，HS-SPME 法为0.66%。棕榈酸甲酯是一类高沸点、高分子量的成分，主要呈现蜡香，气味强度极低，在SDE 法检出为2.44%，而在HS-SPME 法仅为0.04%。水杨酸甲酯是茶叶中重要的甜香、薄荷香风味的贡献者，HS-SPME 的萃取效率较高，为2.82%，而SDE 法仅为0.28%。茉莉内酯、己酸叶醇酯、乙酸苄酯、苯乙酸甲酯等仅在HS-SPME 中被检出，亚麻酸甲酯、邻苯二甲酸二丁酯等仅在SDE 法被检出。

HS-SPME 较SDE 法更适合提取酮类成分，仅β-紫罗兰酮在两种提取方法均有检出，它是茶叶中一类具有木质味、紫罗兰香的成分，可通过β-类胡萝卜素氧化形成[25]，然而，它在肉桂中的含量较低。与SDE 相比，HS-SPME 法检出的酚类和酸类含量较少，可能是因为酚类和酸类成分一般沸点较高，而HS-SPME 相对于SDE 法而言是一种比较温和的萃取方式，萃取温度较低不利于这些成分的萃取。

通过两种提取方法的对比，发现HS-SPME法和SDE 法所得挥发性成分含量和种类存在明显差异。相比于SDE，HS-SPME 法对杂环类化合物、中低沸点脂肪族醇类、烯烃类、酮类的萃取效率高；而SDE 法适合萃取分子量大和挥发性弱的成分，如沸点较高的醇类（叶醇和异植醇）、酚类和酸类。两者对于酯类的萃取效果相当。HS-SPME法相对于SDE 法萃取条件较为温和，有利于萃取挥发性强和热敏性的成分，然而，限制了挥发性较弱成分的提取。SDE 法需在长时间高温条件下反复萃取浓缩，易造成低沸点和热不稳定性挥发性成分的损失，然而，有利于萃取分子量较高、挥发性弱的成分。这两种萃取方法各具特点，可相互补充。使用两种萃取方法可更全面反映肉桂的挥发性成分。

3 结论

本文优化了HS-SPME 提取武夷肉桂挥发性成分的方法，结果表明最优的提取条件为：采用50/30 μm DVB/CAR/PDMS 萃取纤维，萃取温度50 ℃，萃取时间50 min，NaCl 添加量30%，在该条件下共获得84 种挥发性成分。对比了优化的HSSPME 与文献报道的SDE 两种萃取方法对武夷肉桂挥发性成分的提取效果，结果发现二者对肉桂挥发性成分的提取效果存在明显差异，对于酯类的萃取效率相当。HS-SPME 在提取杂环类化合物、中、低沸点脂肪族醇类、烯烃类、酮类的效率高于SDE；而SDE 因提取时间长，提取温度高，更有利于萃取高分子量、高沸点的挥发性成分提取，同时会造成低沸点挥发性成分的损失。综上，结合两种提取方法可全面反映肉桂的香气成分。