酶法制备壳寡糖关键技术研究

壳寡糖（chitooligosaccharides，COS）一般是指2~10 个氨基葡萄糖以β-1,4 糖苷键连接组成的低相对分子质量壳聚糖，通常是由壳聚糖经化学、物理或酶法水解制备。壳寡糖因具有低黏度、高水溶性、高生物相容性以及可生物降解性等物理、化学性质而受到关注，目前已被广泛应用于食品加工、农业生产、生物制药等技术领域。

壳寡糖的制备方法有化学法、物理法及酶法等。 酶法反应主要采用专一性酶(甲壳素酶和壳聚糖酶)与非专一性酶(脂肪酶、果胶酶与纤维素酶等)降解，条件温和，不需要化学药品，节能、高效并无污染，是目前制备COS 使用最多的方法之一。 如中国专利CN202110359224.1 公开了一种制备壳寡糖的方法，其将壳聚糖溶解后配制成壳聚糖溶液，调节pH 后加入壳聚糖酶进行酶解；酶解得到的酶解液依次通过微滤除杂、超滤除杂、浓缩除盐后收集浓缩液，最后将浓缩液冷冻干燥，得到壳寡糖。 该方法以60%以上的收率制备出相对分子质量集中在1 000~3 000 的壳寡糖，制备的壳寡糖水溶性好、生物活性高、生产成本低，适于规模化生产。 CN202110262992.5 涉及壳寡糖的制备方法具体包括：1)壳聚糖胶体化：将壳聚糖溶于酸溶液，得到胶体壳聚糖，进行加热；2)酶解：向胶体壳聚糖中加入复合酶A，升温搅拌后加入复合酶B，恒温搅拌，再加入壳聚糖酶，继续搅拌得到壳聚糖酶解液；3)分离：将壳聚糖酶解液经离心、膜浓缩后，即得壳寡糖。 上述制备方法能够得到一种相对分子质量分布窄、含量高的壳寡糖，进而可将其更有效地应用于肥料、饲料以及农药等领域中。CN202210217665.2 公开了一种制备壳寡糖的方法、壳聚糖酶及其基因、酶制剂与应用，其采用特定的壳聚糖酶酶解壳聚糖或胶质甲壳素生产壳寡糖，酶解条件为pH 4.0～8.0、温度50～80 ℃。该发明的壳聚糖酶可以在高温条件下酶解壳聚糖，高效酶解壳聚糖制备壳寡糖。CN202110584874.6 公开了一种高氨基含量壳寡糖的制备方法，工艺步骤为：配制有机酸水溶液（pH 3～5），缓慢加入壳聚糖固体，搅拌均匀后体系呈悬浮状，壳聚糖的质量分数为8%～12%，进行超声；利用40%氢氧化钠溶液调节pH 至5～7；加入木瓜蛋白酶和纤维素酶组成的复合酶，升温至（55±5） ℃，反应时间为5～8 h；将所得溶液通过微滤膜，再通过纳滤膜浓缩至质量分数为15%～20%，所得溶液进行喷雾干燥制得高氨基含量粉末状壳寡糖产品，所得产品相对分子质量分布较窄，壳寡糖氨基含量高，相对分子质量可以达到3 000 以下。 CN202111263141.9 公开了一种壳寡糖的制备方法，包括以下步骤：1）将酶分散液与活性炭混合，在预设温度下温育预设时间，得到活性炭固载酶分散液；2）将壳聚糖分散于分散介质中，得到壳聚糖分散液；3）将壳聚糖分散液与活性炭固载酶分散液混合，反应得到壳寡糖；其中，酶分散液为第一酶与果胶酶的混合物分散于分散剂而得。CN202110594062.X 公开了一种膜分离工艺制备壳寡糖的方法，具体包括如下步骤：1）选取适量动物外壳原料，洗净，其中动物外壳包括虾壳、蟹壳，应选取甲壳素含量较高的动物外壳作为原料；2）对动物外壳原料进行脱钙、脱蛋白质、脱乙酰基处理；3）对经步骤2 处理的原料进行酶解处理，得到原液；4）将原液导入超滤膜系统，进行超滤膜过滤处理，得到处理液；5）将处理液导入纳滤膜系统，进行纳滤膜过滤，得到浓缩液和清液，清液导入反渗透膜系统进一步过滤后，回收利用；6）对步骤5 处理得到的浓缩液进行干燥处理；该发明整体流程简单，产品纯度高。CN201811573112.0 公开了一种无酸壳寡糖的制备方法，包括以下步骤：将壳聚糖溶于盐酸溶液，加入固定化酶进行酶解，超声波辅助酶解，得到酶解液；对酶解液依次进行超滤膜分离、纳滤膜分离，得到壳寡糖浓缩液；壳寡糖浓缩液通过阴离子交换柱；喷雾干燥，得到无酸壳寡糖。CN202010730417.9 公开了一种特定聚合度的壳寡糖的制备方法，包括以下步骤：1）壳聚糖提纯；2）制备壳聚糖溶液；3）阶段一水解：向壳聚糖溶液中加入非特异性酶，超声反应0.5~1.5 h 之后升温灭活，中和，经离心过滤得聚合度为65~115 的低相对分子质量壳聚糖溶液；4）阶段二水解：向低相对分子质量壳聚糖溶液中加入葡聚糖酶，反应1~2 h 之后升温灭活，中和，经离心过滤得聚合度为5~7 的壳寡糖混合物溶液，经分离、纯化、干燥处理后得聚合度5~7的壳寡糖粉末。

酶法制备壳寡糖条件温和、产率高、绿色无污染，但还不能实现大规模的工业化生产，未来需进一步优化COS 的制备工艺，进一步挖掘COS 的生物学活性及作用机制，开辟新的应用领域。