中药复方液对麻黄素致仔鼠脑组织氧化损伤的影响

左文涛，陈 琛，王小勇*，俞诗源

(1.西北师范大学 生命科学学院，甘肃 兰州 730070;2.甘肃省中医院，甘肃 兰州 730050)

麻黄素又称麻黄碱，是制造冰毒的原料.冰毒是苯丙胺类兴奋剂滥用最为广泛的药物，对青少年的危害极为严重[1].吸食麻黄素会引起中枢神经兴奋，长期使用麻黄素会使人产生依赖性，导致焦虑、失眠、头痛、心悸等病理症状[2]，麻黄素还会影响脑、肝、肾等组织的结构与功能[3-4].研究表明,黄芪具有利尿脱毒与抗氧化和抗焦虑作用[5-6]；川芎具有行气活血，祛瘀止痛的功效[7]，有清除氧自由基、抗脂质过氧化损伤的作用[8].研究还发现当归多糖对麻黄素引起的肝组织损伤有预防作用[9]，黄芪多糖能明显减缓或减轻麻黄素引起的肾组织损伤[10]，但黄芪和川芎液对麻黄素引起的脑组织损伤的影响还未见文献报道.

为了探究黄芪和川芎液对麻黄素脑组织损伤的影响，文中给刚出生的仔鼠注射麻黄素溶液时灌胃中药复方液进行干预，再检测脑组织SOD,CAT活性和MDA含量、额叶皮层结构及Bax蛋白表达的变化，研究分析中药复方液对麻黄素氧化损伤的影响.

1 材料和方法

1.1 试剂及仪器

根据半数致死剂量和成瘾剂量将麻黄素(甘肃省公安厅提供)用蒸馏水配制成2.0, 3.0和4.0 g·L-1的水溶液，冰箱4～6 ℃条件下保存.

中草药黄芪、川芎各500 g，由兰州制药公司提供.根据文献[11]方法，黄芪、川芎各加水2.5 L浸泡1 h，先文火煎煮30 min滤出药液，药渣再加水煎煮30 min滤出药液，将2次药液合并后浓缩，制成50 g·L-1浓度的黄芪、川芎水溶液，在4～6 ℃条件冰箱保存；待使用时取相应的黄芪、川芎液制成1∶1的复方液.

武汉博士德公司的Bax单克隆抗体及免疫组化试剂盒，南京建成生物工程研究所的SOD(超氧化物歧化酶)、过氧化氢酶(CAT)、丙二醛(MDA)检测试剂盒.

1.2 实验动物与给药

从兰州大学基础医学院购买出生1周左右的昆明仔鼠72只(体重5～7 g)，根据文献[12]方法分为对照组、模型组(麻黄素)和中药组(麻黄素+中药)，每24只仔鼠为1组，用递增剂量连续给模型组和中药组腹腔注射麻黄素溶液(1～5 d: 2 g·L-1，6～10 d：3 g·L-1，11～15 d: 4 g·L-1)15 d，每次0.2 mL，每天(早上9:00，下午16:00)2次，给对照组腹腔注射等量的生理盐水.每给麻黄素1 h后，给中药组仔鼠进行中药灌胃(2.0 g·L-1)，同时用等量的生理盐水灌胃对照组和模型组仔鼠，所有仔鼠都可自由进食进水[12].

当给药物动物第5,10,15 d时，脱臼处死，摘取右侧大脑-20 ℃冰箱冻存，将左侧大脑用10%的中性福尔马林液固定.

1.3 酶活性测定

切取上述-20 ℃冻存的动物脑组织,根据试剂盒操作说明进行称量，再按比例加入9倍量的生理盐水，冰浴上进行匀浆，再通过3 000 r·min-1离心(4 ℃，10 min)，吸取上清液，用U-1800型UV-VIS spectrophotometer(Tokyo Japan)分别测定脑组织SOD,CAT和MDA的吸光值.

1.4 组织学观察

分别取各组仔鼠的大脑，参照文献[12-13]方法取其额叶脑区，先行常规石蜡包埋、连续切片(6 μm)，再用甲苯胺蓝染色，标本置于光学显微镜(Olympus，FX-35WA，日本)下观察，利用目镜方格测试系统(随机)测量额叶皮层厚度并拍照.

1.5 免疫化学

参照文献[12]方法将上述脑组织石蜡切片，先利用微波修复抗原，内源性过氧化物酶活性通过H2O2封闭.为了封闭非特异性反应位点，用羊血清正常室温孵育30 min；然后加入一抗Bax(1∶100)和二抗孵育，最后通过HRP酶标记的链霉卵白素孵育，经DAB显色和苏木精染料复染.经上述处理的每组切片选6个典型视野，用Image-proplus 6.0软件分析Bax蛋白在脑组织中平均表达的光密度值[14].

1.6 数据处理

参照文献[15]方法，用SPSS15.0软件进行统计、分析处理数据，用均值±标准差表示数据，显著差异用P<0.05表示，极显著差异用P<0.01表示.

2 结果

2.1 仔鼠大脑SOD活性的变化

实验结果表明，本中药复方液可影响麻黄素损伤仔鼠大脑的SOD活性(图1).实验5 d时，模型组SOD活性升高，差异不显著，但实验10,15 d时，SOD在模型组仔鼠大脑中的活性均低于对照组，差异极显著(P<0.01)；给于中药后仔鼠大脑SOD活性低于对照组，但比模型组高，相较于模型组差异显著或极显著(P<0.05或P<0.01).

**P<0.01与对照组比较；#P<0.05，##P<0.01与模型组比较

2.2 仔鼠大脑MDA含量的变化

实验结果表明,本中药复方液可影响麻黄素损伤仔鼠大脑的MDA含量(图2).实验5 d时，模型组仔鼠大脑MDA的含量降低，差异显著(P<0.05);但实验10,15 d时，MDA在模型组仔鼠大脑中的含量均比对照组高，差异显著或极显著(P<0.05或P<0.01)；与模型组比较，使用中药灌胃后的仔鼠大脑MDA含量又降低，差异显著(P<0.05)或极显著(P<0.01).

*P<0.05，**P<0.01与对照组比较；#P<0.05，##P<0.01与模型组比较，下同.

2.3 仔鼠大脑CAT活性的变化

实验结果表明,本中药复方液可影响麻黄素损伤仔鼠大脑的CAT活性(图3).实验5 d时，模型组仔鼠大脑CAT活性升高，差异显著(P<0.05)，但实验10,15 d时，CAT的活性在模型组仔鼠大脑均低于对照组，差异显著(P<0.05)或极显著(P<0.01)，中药组仔鼠大脑CAT活性低于对照组，但高于模型组，与模型组相比较，差异显著(P<0.05)或极显著(P<0.01).

图3 给药后CAT活性的变化(n=8)

2.4 仔鼠大脑额叶皮层组织结构的变化

实验结果表明,本中药复方液可影响麻黄素损伤仔鼠大脑的额叶结构(图4，5).模型组仔鼠的大脑额叶皮层厚度始终小于对照组，实验10,15 d时差异显著(P<0.05).中药组仔鼠大脑额叶皮层厚度小于对照组，但高于模型组，与模型组相比，差异显著(P<0.05).

图4 给药后额叶皮层厚度的变化(n=8)

实验结果表明,本研究对照组仔鼠大脑额叶的皮层组织结构比较清晰(图5中1，2)，但模型组小鼠大脑额叶皮层组织结构不清晰，脑细胞出现形态改变和凋亡，脑细胞的数量出现减少和排列极不整齐的现象.与模型组比较，使用中药灌胃后的小鼠额叶皮层脑细胞数目有所增加，各层脑细胞的界限比较清楚、整齐(图5中3和4).

1.对照组10 d大脑额叶皮层，标尺=50 μm；2.对照组10 d大脑额叶皮层，标尺=40 μm；3.模型组15 d大脑额叶皮层，标尺=40 μm；4.中药组15 d大脑额叶皮层，标尺=40 μm；5.Bax蛋白在对照组5 d大脑额叶皮层的表达，标尺=30 μm；6.Bax蛋白在模型组15 d大脑额叶皮层的表达，标尺=30 μm；7.中药组15 d大脑额叶皮层Bax蛋白的表达，标尺=30 μm.

2.5 额叶Bax蛋白表达的变化

实验发现，中药复方液影响麻黄素损伤仔鼠大脑额叶Bax蛋白的表达(图5中5，6，7).实验显示Bax蛋白的阳性表达部位被染成棕黄色，阳性表达Bax蛋白的细胞主要集中在额叶皮层的第Ⅱ、Ⅲ、V层的细胞，即在外颗粒层、外锥体层和内锥体层的脑细胞表达.与对照组进行比较，模型组Bax蛋白在仔鼠大脑额叶皮层中阳性表达的细胞密度大，差异极显著(P<0.01).但给中药灌胃的仔鼠，在大脑额叶皮层表达Bax蛋白的阳性细胞的密度有不同程度的降低，相较于模型组差异极显著(P<0.01)(表1).

表1 大脑额叶皮层Bax蛋白的表达(n=8)

3 讨论

3.1 中药对麻黄素损伤仔鼠大脑SOD活性的影响

SOD可以将机体内的超氧阴离子歧化为氧气和过氧化氢，再经过氧化氢酶和过氧化物酶将后者清除，以保护细胞免受损伤[15-16].本研究给仔鼠注射麻黄素5 d时，因为先进入体内的少量麻黄素的刺激作用使机体产生免疫兴奋，机体的抗氧化系统被激活，进而诱导机体合成或产生较多的抗氧化剂，使SOD活性上升.注射麻黄素10,15 d时，由于麻黄素的毒性使脑组织内累积了大量的活性氧自由基,为了对抗自由基的影响作用，SOD被大量消耗，使得仔鼠脑组织的SOD活性降低[12].研究表明，如果给小鼠灌胃百合多糖,由麻黄素引起的肺组织损伤中的抗氧化物酶活性又升高[17].黄芪含有多种氨基酸、多糖、维生素和微量元素，黄芪多糖具有良好的抗氧化能力，能够保护神经系统[5,18]，川芎嗪能增强线粒体的抗氧化能力和机体对氧自由基的清除能力，提高超氧化物歧化酶的活性，可以改善机体微循环[19].给仔鼠灌胃中药复方液能增强组织SOD活性或机体的抗氧化能力，清除机体内的活性氧自由基[12]，使脑组织SOD活性升高.上述结果表明，中药复方液能有效减轻麻黄素对脑组织的氧化损伤，对仔鼠脑组织有一定的保护作用.

3.2 中药对麻黄素损伤仔鼠大脑MDA含量的影响

MDA是细胞脂质过氧化物的降解产物，能直接损伤生物膜，其在组织内含量的多少反映机体细胞受自由基攻击及老化的水平[12,15,20].本研究给仔鼠注射麻黄素5 d时，由于进入体内的少量麻黄素的作用，刺激了机体的抗氧化系统，引起机体进一步合成或产生较多的抗氧化剂，增强清除自由基的能力，促使MDA含量下降.但注射麻黄素10,15 d时，由于在体内积累了较多的麻黄素，机体的抗氧化机制被干扰，进而影响了抗氧化酶的活性，自由基不可能被机体及时清除，使得仔鼠脑组织中MDA含量增加[12,21].研究表明，给麻黄素损伤小鼠使用当归多糖能使肝组织中的SOD活性明显升高,MDA含量显著降低[9].黄芪多糖具有清除自由基的能力，川芎含有的阿魏酸具有很强的抗氧化能力，给仔鼠灌胃中药复方液能清除机体内的活性氧自由基,减少机体细胞的脂质过氧化反应[15]，从而使得脑组织MDA含量下降[12].上述结果证明中药复方液能有效减轻麻黄素对脑组织的氧化损伤.

3.3 中药对麻黄素损伤仔鼠大脑CAT酶活性的影响

CAT能将组织歧化反应过程中产生的H2O2连续分解成水和氧气，从而降低H2O2对机体的毒性作用.CAT广泛存在于动植物细胞的微体中，它能使组织的羟基自由基含量降低[15,22]，如果组织H2O2大量积累就会损伤机体的抗氧化酶系统[22].本研究注射麻黄素5 d时，由于少量麻黄素的作用激活了机体的抗氧化系统，使得CAT活性上升;但注射麻黄素10,15 d时，由于麻黄素的毒性作用使脑组织产生过量的羟基自由基，又无法被抗氧化酶及时清除，从而氧化修饰或破坏CAT的结构，使其与底物的结合能力降低[15]，导致CAT的活性降低[12,22].研究表明,中药复方液能使麻黄素成瘾小鼠肾组织CAT的活力升高[11]，给仔鼠灌胃中药复方液，仔鼠脑组织CAT活力升高，表明中药复方液能增强脑组织的抗氧化能力，有效减轻麻黄素对脑组织的氧化损伤.

3.4 中药对麻黄素损伤仔鼠大脑额叶皮层结构的影响

麻黄素属于拟交感类神经兴奋剂，能增加体内的多巴胺和去甲肾上腺素等神经递质[15]，是肾上腺素递质促进药[23]，可兴奋大脑皮层以及皮层下呼吸中枢与心血管中枢[24].麻黄素不仅具有广泛的药理作用，还具有较多的毒副作用，对心血管系统、肾脏、性腺、肝脏、肺等都具有一定的毒害作用[2,25]，导致神经系统损伤，可引起精神病发作、癫痫、头晕等，引发大脑皮层细胞发生变形、凋亡[12,14,21].本研究给仔鼠注射麻黄素溶液，仔鼠脑组织抗氧化物酶活性下降，机体抗氧化能力下降，导致仔鼠大脑额叶皮层组织细胞发生改变、凋亡，各层细胞间界限模糊[12,14].有研究表明，注射海洛因会造成小鼠视网膜组织损伤[26]，但再给灌胃枸杞水提液能使海洛因损伤的视网膜组织得到部分修复[27].黄芪能够提升机体免疫力，且具有镇痛、镇静的作用;川芎能够明显改善脑部血液循环，加快微循环，帮助机体进行代谢，排出毒素.给仔鼠灌胃中药复方液，仔鼠大脑额叶皮层细胞数目有所增加，各层细胞界限比较清楚，部分细胞形态得到恢复，表明中药复方液能有效减轻麻黄素对脑组织的损伤，对仔鼠脑组织有一定的保护作用.

3.5 中药对麻黄素损伤仔鼠大脑额叶皮层Bax蛋白表达的影响

大脑的发育是在特定的环境、时间、位置条件下进行的过程，它要经过细胞增殖、分化及迁移等生理过程，对外在环境因素非常敏感.在脑发育的过程中，如果发育的环境条件发生变化，就可能会引起发育异常或组织发生紊乱，影响大脑的正常功能[28].Bax蛋白为促凋亡的细胞蛋白[29]，当其表达过量时，就有可能形成同型二聚体促进细胞凋亡[9].已有研究表明[30]，可卡因和海洛因等兴奋剂都能诱导细胞凋亡，给仔鼠注射麻黄素溶液后，仔鼠脑组织Bax蛋白阳性表达细胞的平均光密度升高，麻黄素诱导细胞凋亡.枸杞水提液能使海洛因损伤小鼠视网膜组织Bax蛋白的阳性表达降低[31]，百合水溶液能使麻黄素损伤小鼠肺组织相关蛋白的阳性表达降低[32]，中药复方液对麻黄素致损伤仔鼠肝组织Bax蛋白的表达有影响[33],黄芪、川芎有镇静、安神、减缓焦虑的功能，并能提高机体免疫能力[34].另外，黄芪、川芎还能改善肾的微循环，促进肾的血流量，促进机体尿的排放，减轻麻黄素的毒性作用[11].给仔鼠灌胃中药复方液，仔鼠脑组织Bax蛋白的阳性表达降低，减少了组织细胞的凋亡，表明本中药复方液能减轻麻黄素对脑组织的氧化损伤[12].

综上所述，中药复方液能提高仔鼠脑组织的抗氧化能力，降低细胞的脂质过氧化作用，可减少细胞凋亡，能减轻麻黄素对脑组织的损伤.