九龙藤茎化学成分和抑菌活性研究

杨彩霞，韩冰洋，姚书蓉，苏瀛鹏

(西北师范大学 化学化工学院，甘肃省高分子材料重点实验室，生态环境相关高分子材料教育部重点实验室，甘肃 兰州 730070)

九龙藤Bauhiniachampionii(Benth.)Benth，别名乌郎藤、羊蹄藤、龙须藤等，属豆科羊蹄甲属木质藤本植物，广泛分布于江浙、两广、两湖以及福建、贵州等地[1-2].该药物性苦、涩、平，具有多方面的生物活性，如抗炎镇痛[3]、抗感染[4]、治疗类风湿性关节炎[5]、抗凝血[6]等作用.关于九龙藤的化学成分，据文献报道有黄酮类[7]、甾醇[8]、芳香酸(酯)类等[9-10].文中在前期工作的基础上[7]，对九龙藤的化学成分进一步做了研究，分离得到了15个非黄酮类化合物，经IR,1HNMR,13CNMR等分析方法，鉴定出它们的结构分别为：β-谷甾醇(1)，正三十烷(2)，正六十烷(3)，羽扇豆醇(4)，β-香树脂醇(5)，计曼尼醇(6)，cameroonan-7α-ol(7)，silphiperfolane-3,5,6-trio1(8)，齐墩果酸(9)，β-胡萝卜苷(10)，没食子酸(11)，3,4-二羟基苯甲酸乙酯(12)，阿魏酸(13)，3,4-二甲氧基-5-羟基苯甲酸(14)和4-羟基-3-甲氧基苯甲酸(15).其中，化合物3～4，7～9和12～14为首次从该植物中得到.抑菌活性测试表明，该植物的乙酸乙酯提纯物和正丁醇提纯物均表现出较好的抑菌活性.相对而言，乙酸乙酯提纯物的抑菌效果更好，对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、福氏志贺氏菌、金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌的最低抑菌浓度(MIC)分别为7.81,62.5,31.25,7.84和3.91 mg·mL-1.

1 仪器与材料

Nicolet 170SX FT-IR红外光谱仪，KBr压片；EI-MS 谱,HP-5988A 光谱仪测定(离子化能为70 eV)；Varian Mercury 400 plus核磁共振仪(TMS为内标)；柱色谱用硅胶(100～200目，200～300目)，薄层色谱用硅胶(GF254、硅胶G等)，青岛海洋化工有限公司；Sephadex LH-20，Amersham Blosclences 公司.环丙沙星(纯度98%)，广州桐晖药业有限公司；水解络蛋白(pH=7.2～7.4)，上海剑钝生物有限公司.所用试剂皆为分析纯或化学纯.

九龙藤(茎部切片)2020年购于福建龙岩，由西北师范大学生命科学学院陈学林教授鉴定.标本(编号20200912)现存于西北师范大学化学化工学院化学天然产物化学研究室.

2 提取与分离

干燥的九龙藤茎部切片，取3.4 kg粉碎后，依据常规浸提法用95%的乙醇浸提、浓缩得浸膏531 g，将此浸膏溶于水后分部位萃取，回收溶剂后得到石油醚(60～90 ℃)、氯仿、乙酸乙酯和正丁醇4个部分提纯物.石油醚部分(6 g)采用硅胶柱色谱层析法，以石油醚(60～90 ℃)-氯仿进行梯度洗脱，用TLC检测、重结晶纯化后，得化合物1(15 mg)，2(18 mg)，3(21 mg)，4(10 mg)，5(20 mg)和6(17 mg).乙酸乙酯部分(186 g)以硅胶柱层析法，氯仿-甲醇梯度洗脱，结合TLC检查、重结晶纯化，得到化合物7(12 mg)，8(22 mg)，9(10 mg)和11(22 mg).正丁醇部分(138 g)经硅胶柱层析法，Sephadex LH-20 柱色谱，结合制备薄层色谱和重结晶法，得到化合物10(26 mg)，12(50 mg)，13(22 mg)，14(22 mg)和15(9 mg).化合物1～15的结构见图1.

图1 化合物1～15的结构

3 结果与讨论

化合物1：白色针状晶体(石油醚-丙酮)，分子式为C29H50O，EIMS(m/z): 414[M]+.5% H2SO4-乙醇溶液显紫红色，紫外灯下(254 nm)无荧光.IR(KBr)cm-1: 3 340(-OH),1 665(C=C)，2 963，2 854，1 049.1HNMR(400 MHz,CDCl3)δ: 5.35(1H,t,J=2.8,5.0 Hz,H-6),3.53(1H,m,H-3),1.12(3H,s,H-19),0.97(3H,d,J=6.4 Hz,H-21),0.83(6H,d,J=1.7 Hz,H-26,27),0.70(3H,s,H-18),0.85(3H,t,J=1.7,6.4 Hz,H-29),0.84(3H,m,H-28).以上波谱数据与文献[11]报道基本一致.同时，在同一展开体系中该化合物与β-谷甾醇标样进行TLC检测，Rf值相同.因此，化合物1鉴定为β-谷甾醇.

化合物2：白色片状结晶(石油醚)，分子式C30H62，EIMS(m/z): 422[M]+.IR(KBr)cm-1: 2 916,2 840,1 473,1 058,723.1HNMR(400 MHz,CDCl3)δ: 0.86(6H,t,J=1.8,6.0 Hz,2CH3),1.26(56H,m,28CH2).以上数据与文献[12]报道一致.同时在石油醚-氯仿和石油醚-乙酸乙酯为展开溶剂时，化合物2与正三十烷标准品的Rf值均相同，因此，化合物2鉴定为正三十烷.

化合物3：白色片状固体(石油醚-氯仿)，分子式C60H122，EIMS(m/z): 842[M]+.IR(KBr)cm-1: 2 925,2 853,1 485,1 354,1 180.在石油醚-乙酸乙酯和石油醚-氯仿的展开系统中，化合物3和标准品六十烷的比移值Rf值均相同.因此，化合物3鉴定为正六十烷，其红外数据与文献[13]一致.

化合物4：白色片状晶体(石油醚-丙酮)，分子式为C30H50O，ESIMS(m/z): 427.5[M+H]+.5% H2SO4-乙醇溶液显紫红色，Libermann-Burchard 反应呈阳性，紫外灯下(254 nm)无荧光.IR(KBr)cm-1: 3 377(OH),1 640(C=C),2 947,2 853,1 046.1HNMR(400 MHz,CDC13)δ: 4.64(1H,d,J=2.0 Hz,Ha-29),4.50(1H,d,J=2.1 Hz,Hb-29),3.18(1H,dd,J=5.2,10.4 Hz，H-3α),0.96,0.75,0.81,1.01,0.94,0.78(各3H,s,H-23～28),1.67(3H,s,H-30).13CNMR(100 MHz, CDC13)δ: 38.52(C-1),27.55(C-2),79.51(C-3),38.35(C-4),55.53(C-5),18.09(C-6),34.26(C-7),40.53(C-8),50.20(C-9),36.95(C-10),21.51(C-11),25.40(C-12),38.11(C-13),43.38(C-14),27.48(C-15),35.34(C-16),43.11(C-17),47.27(C-18),48.52(C-19),150.48(C-20),29.77(C-21),40.02(C-22),27.91(C-23),15.36(C-24),16.03(C-25),14.03(C-26),14.82(C-27),18.30(C-28),109.40(C-29),19.31(C-30).以上波谱数据与文献[14]一致，确定化合物4为羽扇豆醇.

化合物5：白色针状晶体(石油醚-丙酮)，分子式为C30H50O，EIMS(m/z): 426[M]+.紫外灯下(254 nm)无荧光，5% H2SO4-乙醇溶液显紫红色.IR(KBr)cm-1: 3 330(OH),1 637(C=C),2 955,2 850.1HNMR(400 MHz, CDC13)δ: 5.20(1H,t,J=4.0 Hz,H-12),3.22(1H,t,J=4.4,6.4 Hz,H-3α),1.15,0.76,0.93,0.97,1.24,0.84(各3H,s,H-23～28),0.88(6H,s,H-29,30).13CNMR(100 MHz,CDC13)δ: 38.62(C-1),27.03(C-2),79.14(C-3),39.30(C-4),55.23(C-5),18.32(C-6),32.40(C-7),40.64(C-8),49.51(C-9),36.11(C-10),23.59(C-11),122.03(C-12),143.36(C-13),41.61(C-14),25.35(C-15),26.71(C-16),31.21(C-17),47.45(C-18),46.83(C-19),35.87(C-20),34.78(C-21),37.04(C-22),28.43(C-23),14.91(C-24),15.63(C-25),16.90(C-26),25.88(C-27),28.24(C-28),33.41(C-29),23.59(C-30).以上波谱特征与文献[15]报道的相一致，因此化合物5鉴定为β-香树脂醇.

化合物6：白色粉末(石油醚-丙酮)，分子式：C30H50O，EIMS(m/z): 426[M]+.5% H2SO4-乙醇溶液显紫红色，Libermann-Burchard反应呈阳性，紫外灯下(254 nm)无荧光.1HNMR(400 MHz，CDC13)δ: 3.22(1H,dd,J=11.5,6.2 Hz,H-3),4.88(1H,s,H-19),0.74,0.85,0.75(各3H,s,H-23～25),0.95(6H,sH-26,27),0.98,1.02,1.06(各3H,s,H-28～30).13CNMR(100 MHz, CDCl3)δ: 38.49(C-1),27.32(C-2),79.51(C-3),38.37(C-4),55.47(C-5),18.20(C-6),35.56(C-7),41.67(C-8),51.03(C-9),37.82(C-10),22.43(C-11),26.37(C-12),38.58(C-13),44.81(C-14),27.51(C-15),37.61(C-16),34.20(C-17),144.34(C-18),128.52(C-19),32.83(C-20),34.20(C-21),37.34(C-22),27.63(C-23),15.56(C-24),16.22(C-25),15.84(C-26),14.03(C-27),25.02(C-28),32.29(C-29),28.31(C-30).以上波谱数据与文献[16]报道的计曼尼醇相一致.

化合物7：无色油状(氯仿)，分子式为C15H26O，EIMS(m/z): 222[M]+,204(18),135(100).5% H2SO4-乙醇溶液显浅蓝色，紫外灯下(254 nm)无荧光.1HNMR(400 MHz，CDCl3)δ: 0.93(s,4-CH3),0.97(s,6α-CH3),1.02(d,J=6.5 Hz,9-CH3),1.05(s,6β-CH3),1.41,1.55(各1H,J=14.0 Hz,H-5),1.90(1H,m,J=7.2,1.5 Hz,H-1),3.72(s,7-H).13CNMR(100 MHz，CDCl3)δ: 51.50(C-1),29.62(C-2),39.47(C-3),47.65(C-4),53.54(C-5),38.33(C-6),89.61(C-7),68.13(C-8),44.21(C-9),35.73(C-10),36.39(C-11),26.43(C-12),24.60(C-13),32.81(C-14),19.43(C-15).以上波谱数据与文献[17]报道的cameroonan-7a-ol相一致.

化合物8：白色固体，5% H2SO4-乙醇溶液显淡蓝色，紫外灯下(254 nm)无荧光.分子式为C15H26O3，EIMS(m/z): 254[M]+.1HNMR(400 MHz, DMSO-d6)δ: 4.65(1H,dd,J=10.4,5.8 Hz,H-3),3.35(1H,s,H-5),1.45(1H,d,J=6.4Hz,H-7),1.00(3H,s,4-CH3),1.17(3H,s,6-CH3),0.99(3H,d,J=6.4 Hz,7-CH3),0.95(3H,d,J=6.4 Hz,9-CH3).13CNMR(100 MHz,DMSO-d6)δ:50.03(C-1),33.21(C-2),74.02(C-3),63.67(C-4),78.58(C-5),85.97(C-6),47.53(C-7),55.61(C-8),40.57(C-9),37.54(C-10),26.83(C-11),9.60(C-12),18.24(C-13),19.32(C-14),18.37(C-15).确定化合物8的结构为silphiperfolane-3,5,6-trio1[18].

化合物9：白色无定型粉末(石油醚-氯仿)，分子式为C30H48O3，EIMS(m/z): 456[M]+.5% H2SO4-乙醇溶液显紫红色，紫外灯下(254 nm)无荧光.1HNMR(400 MHz, CDCl3)δ: 5.31(1H,t,J=3.4 Hz,H-12),3.22(1H,dd,J=10.4,4.6 Hz,H-3),2.85(1H,dd,J=13.6,4.4 Hz,H-18),1.16,0.79,0.95,0.96,0.86(各3H,s,H-23～27),0.94,0.84(各3H,s,H-29,30).13CNMR(100 MHz, CDCl3)δ: 38.57(C-1),24.28(C-2),78.24(C-3),36.83(C-4),56.21(C-5),18.47(C-6),32.60(C-7),35.40(C-8),45.50(C-9),35.04(C-10),24.01(C-11),123.96(C-12),144.62(C-13),41.68(C-14),26.61(C-15),26.27(C-16),48.13(C-17),45.23(C-18),46.88(C-19),33.77(C-20),35.74(C-21),33.52(C-22),28.50(C-23),17.51(C-24),17.30(C-25),17.36(C-26),25.03(C-27),176.03(C-28),35.23(C-29),26.01(C-30).化合物9的波谱数据与文献[19]报道的齐墩果酸一致.

化合物10：白色片状晶体(氯仿-甲醇)，分子式为C35H60O6，EIMS(m/z): 576[M]+.紫外灯下(254 nm)无荧光，5% H2SO4-乙醇溶液显紫红色.IR(KBr)cm-1: 3 411(OH),1 637(C=C),2 960,2 854.1HNMR(400 MHz, CD3OD)δ: 5.24(1H,br,s,H-6),3.72(1H,m,H-3),5.20(1H,d,J=7.8 Hz,H-1′),0.81(3H,d,J=6.2 Hz,H-21),0.89(3H,d,J=6.4 Hz,H-26),0.90(3H,d,J=2.4 Hz,H-27),0.95(3H,t,J=1.6,6.4 Hz,H-29),3.92-4.60(6H,m,Glc-H),0.65,0.80(各3H,s,H-18,19).13CNMR(100 MHz,CD3OD)δ: 37.45(C-1),27.54(C-2),78.41(C-3),38.52(C-4),140.49(C-5),122.23(C-6),33.45(C-7),31.67(C-8),51.19(C-9),37.45(C-10),22.18(C-11),39.41(C-12),42.61(C-13),55.77(C-14),27.01(C-15),29.56(C-16),57.20(C-17),13.25(C-18),12.51(C-19),35.78(C-20),18.77(C-21),34.30(C-22),25.60(C-23),46.58(C-24),29.17(C-25),19.80(C-26),19.46(C-27),23.03(C-28),20.31(C-29),103.03(C-1′),75.50(C-2′),78.67(C-3′),71.23(C-4′),78.02(C-5′),62.87(C-6′).以上波谱数据与文献[20]的β-胡萝卜苷相一致.

化合物11：黄色固体(氯仿-甲醇)，紫外灯下(254 nm)有荧光.分子式为C7H6O5，EIMS(m/z): 170[M]+.1HNMR(400 MHz,CD3OD)δ: 7.15(2H,s,H-2,6).13CNMR(100 MHz, CD3OD)δ: 169.57(-COOH),121.29(C-1),109.51(C-2,6),137.65(C-4),145.23(C-3,5).以上波谱数据与文献[21]报道没食子酸相一致.

化合物12：白色粉末(氯仿-甲醇)，分子式为C9H10O4，EIMS(m/z): 182[M]+.1HNMR(400 MHz, CD3OD)δ: 7.42(1H,d,J=1.6 Hz,H-2),7.40(1H,dd,J=1.6,8.0 Hz,H-6),6.76(1H,d,J=8.0 Hz,H-5),4.25(2H,q,J=7.2 Hz,H-8),1.37(3H,t,J=7.2 Hz,H-9).13CNMR(100 MHz,CD3OD)δ: 123.54(C-1),115.82(C-2),146.19(C-3),151.67(C-4),117.35(C-5),122.90(C-6),168.87(C-7),61.82(C-8),15.30(C-9).化合物12的波谱数据与文献[22]报道的相一致，因而鉴定12为3,4-二羟基苯甲酸乙酯.

化合物13：白色晶体(甲醇)，紫外灯下(254 nm)有荧光.分子式为C10H10O4，EIMS(m/z): 193[M-H]+.1HNMR(400 MHz,DMSO-d6)δ: 7.54(1H,d,J=15.6 Hz,H-7),7.12(1H,dd,J=8.8,1.2 Hz,H-6),7.03(1H,d,J=1.2 Hz,H-2),6.95(1H,d,J=8.8 Hz,H-5),6.21(1H,d,J=15.6 Hz,H-8),3.87(3H,s,OCH3).13CNMR(100 MHz, DMSO-d6)δ: 168.61(-COOH),123.44(C-1),112.90(C-2),145.46(C-3),149.27(C-4),105.34(C-5),115.47(C-6),145.31(C-7),113.60(C-8),55.83(3-OCH3).化合物13波谱特征与文献[23]报道阿魏酸一致.

化合物14：白色无定型粉末(甲醇)，紫外灯下(254 nm)有荧光.分子式C9H10O5，EIMS(m/z): 197[M-H]+.1HNMR(400 MHz, CD3OD)δ: 7.13(1H,d,J=1.6 Hz,H-6),7.08(1H,d,J=1.6 Hz,H-2),3.79(3H,s,OCH3),3.75(3H,s,OCH3).13CNMR(100 MHz, CD3OD)δ: 169.53(—COOH),127.02(C-1),106.41(C-2),154.51(C-3),141.80(C-4),151.32(C-5),112.28(C-6),58.24(OCH3),55.70(OCH3).以上波谱数据与文献[24]报道相一致，故化合物14鉴定为3,4-二甲氧基-5-羟基苯甲酸.

化合物15：白色针晶(丙酮)，分子式C8H8O4，EIMS(m/z): 163[M-H]+.1HNMR(400 MHz,CD3OD)δ: 12.73(1H,s,-COOH),7.43(H,br s,H-2),6.84(1H,d,J=8.4 Hz,H-5),7.45(1H,br d,J=8.4Hz,H-6),3.85(3H,s,OCH3).13CNMR(CD3OD, 100 MHz)δ: 167.62(CO),123.30(C-1),115.14(C-2),147.52(C-3),151.34(C-4),112.73(C-5),121.44(C-6),55.57(OCH3).以上数据与文献[25]对比，化合物15鉴定为4-羟基-3-甲氧基苯甲酸.

4 抑菌活性实验

将一定量的九龙藤用乙酸乙酯提纯部分和正丁醇提纯部分药液与环丙沙星用灭菌的生理盐水溶解，再用水解络蛋白(MH)肉汤逐次倍半稀释后，分别滴入96孔细胞培养板中(每孔100 μL)，然后将显微镜下计数的大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、福氏志贺氏菌、阪崎肠杆菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌和表皮葡萄球菌等的菌液，用MH肉汤将菌液稀释到1×105cfu·mL-1，依次加入96孔细胞培养板中，于37 ℃培养18～20 h.以孔板中的肉汤澄清且无浑浊孔的最低浓度为药液和环丙沙星的最低抑菌浓度(MIC).实验结果显示，九龙藤乙酸乙酯提纯部分和正丁醇提纯部分的药液，除了对铜绿假单胞菌和阪崎肠杆菌无抑菌作用外，对其余细菌的生长均表现出明显的抑制作用.相对而言，乙酸乙酯提纯物有更好的抑菌作用，其对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、福氏志贺氏菌、枯草芽孢杆菌和表皮葡萄球菌的MIC值分别为：7.81，7.84，31.25，62.5和3.91 mg·mL-1.九龙藤乙酸乙酯部分和正丁醇部分表现出较好的抑菌活性，与其中的黄酮类化合物及酚类化合物相关[4].