生脉散对心衰大鼠心肌重塑及TGF-β1∕Smad3信号通路的影响*

赵 地 赵 添 赵 卓 高 妍 董振飞 王世军△

（1.山东第一医科大学第三附属医院，山东 济南 250031；2.山东省中西医结合医院，山东 济南 250001；3.山东大学附属济南市中心医院，山东 济南 250014；4.山东中医药大学，山东 济南 250355）

心力衰竭是多种心脏疾病导致的心脏功能异常，是众多心脏病的终末期表现形式［1］。研究表明，心力衰竭发生发展的基本机制是心室重构，而心肌肥厚和心肌纤维化是其重要的病理基础［2］。心肌肥厚主要以心肌细胞体积增大、蛋白质的间质成分改变，同时伴有心室形态结构减退为主要病理特征，是心肌重构的主要表现之一，心肌纤维化可以导致心肌僵硬度增加、顺应性降低和心脏的舒缩功能下降，预防心室重构已经成为心力衰竭治疗的主要靶点［3］。研究发现，转化生长因子-β1（TGF-β1）∕Smad3经典通路参与了所有心血管相关的疾病，在心肌纤维化过程中该信号通路起主导作用［4］。故干预TGF-β1∕Smad3通路可能有助于延缓心肌纤维化进展。

中医学把本病归于“心悸”“喘证”“水肿”等范畴。患者常有心悸、气短、乏力、自汗或盗汗、舌红少苔、脉细无力等表现，有学者发现气虚、阴虚为慢性心力衰竭的重要证候要素［5］。生脉散是益气养阴的名方，由人参、麦冬、五味子组成。研究表明，生脉散可用于治疗心力衰竭和改善心功能的作用［6］，但其作用机制仍不清楚。本研究探讨生脉散是否通过抑制TGF-β1∕Smad 3表达改善心衰大鼠的心肌重构，为生脉散的临床应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物 健康清洁级SPF级SD雄性大鼠50只，体质量250～300 g，8～10周龄，购于北京维通利华实验公司，许可证号：SCXK（京）2019-0028，饲养于山东省医学科学院基础所，在SPF级实验动物设施中饲养，食水充足，保持温度22～25℃，自由取食。本动物实验经山东省医学科学院伦理委员会批准（批准号2019-1222）。

1.2 试药及仪器 人参、麦冬、五味子购自山东省医科院药物所，厄贝沙坦（赛诺菲公司，批号SM20190813），HE染色试剂盒（C0105）、RIPA裂解液（P015B）、Masson染色试剂盒（SBJ-0288）购自南京森贝伽生物公司，Ⅰ型胶原（Col-Ⅰ）（F1062）、Ⅲ型胶原（Col-Ⅲ）（F1055）试剂盒购自济南立言公司，TGF-β1（ab92486）、Smad3（RLM3123）、p-Smad3（RLP0585）购自美国Abcam公司，GAPDH（5174）购自美国CST公司。仪器DM3000型光学显微镜（德国Leica公司），Vevo2100型小动物超声系统（加拿大Visual Son公司），ES-2型紫外光度仪（日本Malcom公司），EPS-300型电脉仪与转膜仪（美国伯乐公司），CM1950冰冻切片机（德国Leica公司）；Stepone荧光定量PCR仪（美国ABI公司）。生脉散的制备：根据文献研究［7］方中各药物用量为人参9 g，麦冬9 g，五味子6 g。称取以上药物，加纯净水浸泡1 h后煮沸，将药液滤出，再次煎煮30 min，将2次煎煮药液混合。大鼠灌胃剂量按照成人的用量∕70 kg×6.3，配制成生药浓度为0.25 g∕mL的生脉散灌胃溶液，大鼠灌胃剂量为2.5 g（∕kg·d）［8］。

1.3 造模与分组 诱导大鼠心力衰竭模型：腹腔注射0.08%戊巴比妥钠（40 mg∕kg）麻醉，气管切开插管后，以胸骨左缘第2肋间隙切开约1～1.5 cm切口。剪断肋骨，打开胸腔，暴露主动脉弓，与主动脉弓平行放置28号针头，结扎使主动脉狭窄约60%～70%，缝合切口，等待大鼠苏醒。对照组采用相同步骤，但不结扎主动脉。术后4周行超声评价左室射血分数（EF）＜50%为造模成功［9］。对照组和模型组给予［10 mL（∕kg·d）］生理盐水灌胃，生脉散低剂量组给予2.5 g（∕kg·d）的中药灌胃；生脉散高剂量组给予5.0 g（∕kg·d）中药灌胃，厄贝沙坦给予15 mg（∕kg·d）混悬液灌胃，连续给药8周。

1.4 标本采集 1）药物干预8周，禁食、不禁水12 h，称重，腹腔注射麻醉，腹主动脉采血5 mL，3 000 r∕min离心10 min，留取血浆，置于-20℃冰箱保存待测。采血后处死大鼠，摘取心脏，留取左室心肌组织，4%多聚甲醛固定，脱水，石蜡包埋，用于病理染色，剩余心肌组织转移至-80℃冰箱保存。

1.5 观察指标 1）心功能指标检测：大鼠麻醉后，仰卧固定，用超声心动图仪10 MHz高频探头置于左胸骨旁，显示左室长轴切面，获得M型超声心动图，测定左室舒张末期内径（LVIDd）、左室收缩末期内径（LVIDs）、EF、短轴收缩率（FS）。连续记录3个心动周期数据。2）HE染色观察心脏组织学：4%多聚甲醛固定心脏组织48 h后，乙醇梯度脱水进行石蜡包埋，切成3～4 μm的石蜡薄片进行HE染色。3）Masson染色观察心脏纤维化：制成石蜡切片后常规脱蜡，复染并梯度脱水后，用中性树胶封片，于光镜下观察心肌纤维化情况。4）实时荧光定量（RT-PCR）检测胶原蛋白collagenⅠ、collagenⅢ的表达：取约100 mg心肌组织，用TRIzol法提取心肌组织总RNA，紫外分光光度计测定RNA浓度，应用Takara反转录、PCR反应。通过溶解曲线，基因测序确定产物的准确性，mRNA表达程度采用相对定量计算。将β-actin作为内参基因，引物序列如下：CollagenⅠ上游：5'-TGCTCATAGCAGCCCCCTCCG-3'，下游：5'-TCCTTGACTTGGGAAGGTT-3'。CollagenⅢ上游：5'-AGGCCAATGGCAATGTAAAG-3'，下游：5'-TGTCTTGCTCCATTCACCAG-3'。β-actin上游：5'-CGTAAAGACCTCTATGCCAACA-3'，下游：5'-TGTC TTGCTCCATTCACCAG-3'。5）Western blotting检测：收集100 g组织匀浆后，加入RIPA细胞裂解液1 mL，冰上裂解30 min，取上清液，进行蛋白浓度测定，上样后进行电泳、转膜，用5%脱脂牛奶封闭1 h后，按计算好的蛋白浓度，依次加样、凝胶电泳、转模、恒温封，加入稀释好的一抗TGF-β1（1∶3 000）、Smad3（1∶2 000）、p-Smad3（1∶1 000）、β-actin（1∶1 000）的单克隆一抗4℃孵育PVDF膜过夜，室温孵育二抗2 h，洗膜后加入ECL发光液显影条带，用Image J量化蛋白表达量。

1.6 统计学处理 应用Graphpad Prism5.0统计软件。计量资料以（）表示，多组间比较采用方差分析，两组比较采用t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组大鼠基本情况 见图1。药物干预8周后，对照组大鼠生长发育良好，摄食摄水正常，反应灵敏，毛色有光泽，精神状态好，未见异常反应，无死亡。模型组大鼠术后随着干预时间延长表现出毛发无光泽，活动力降低、呼吸急促、食欲下降，精神萎靡且易怒，死亡2只。给予药物干预的大鼠的状况较模型组有好转，体重增加，摄食摄水正常，反应正常，无死亡。超声心动图显示，模型组LVIDd、LVIDs明显高于对照组（P＜0.01），表明心衰模型建立成功。

图1 大鼠心脏M型超声心动图切面图像

2.2 各组大鼠心脏结构超声参数比较 见表1，图1。与对照组相比，模型组大鼠LVIDd、LVIDs明显升高（P＜0.01），LVEF、LVFS明显降低（P＜0.01）；与模型组比较，生脉散低、高剂量组LVIDd、LVIDs降低（P＜0.01），LVEF、LVFS升高（P＜0.01），厄贝沙坦组LVIDd、LVIDs降低（P＜0.01），LVEF、LVFS升高（P＜0.01）。提示生脉散可以减轻心衰大鼠心室代偿性增大，改善其心功能。

表1 各组大鼠心脏超声参数比较（±s）

表1 各组大鼠心脏超声参数比较（±s）

注：与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与对照组比较，△P＜0.05。下同。

组 别n LVIDd（mm）LVIDs（mm）LVEF（%）LVFS（%）对照组模型组生脉散低剂量组生脉散高剂量组厄贝沙坦组10 10 10 10 10 5.92±0.15 8.46±0.22△6.74±0.37**6.12±0.43*6.36±0.12*2.28±0.21 5.55±0.38△4.73±0.22*3.57±0.36*3.52±0.44*80.31±3.21 55.77±4.52△65.27±8.24*74.55±7.56*70.28±6.26*50.33±6.34 30.69±5.32△36.74±4.33*40.62±2.35*38.4±3.35*

2.3 各组大鼠心脏组织HE染色结果 见图2。镜下可见，假手术组心肌组织结构清晰、心肌细胞染色均匀、整齐，未见明显细胞增大。模型组心肌细胞排列紊乱，部分细胞肿大、细胞核增大，间质可见纤维结缔组织增生并有炎症细胞浸润。生脉散低剂量组和厄贝沙坦组心肌细胞排列较紊乱，局部有心肌细胞增大，伴有零星炎性细胞浸润；生脉散高剂量组心肌细胞排列整齐，间质内炎性细胞浸润明显减少。

图2 各组大鼠心肌细胞形态（HE染色，200倍）

2.4 各组大鼠心脏组织Masson染色结果 见图3。光镜下可见Masson染色后心肌细胞呈红色，胶原纤维呈蓝色。对照组心肌纤维排列整齐，横纹较清楚，肌纤维连接完好。而模型组心肌肌束间隙增大，心肌细胞间质可见明显纤维化改变，伴严重胶原沉积。生脉散高剂量组：肌纤维排列整齐，可见极少量的胶原纤维。生脉散低剂量组和厄贝沙坦组：肌纤维排列局部紊乱，观察到少量胶原纤维沉积。

图3 各组大鼠心肌组织（Masson染色，200倍）

2.5 各组大鼠心肌collagenⅠ、collagenⅢ的表达水平比较 见表2。与对照组比较，模型组大鼠心肌中collagenⅠ、collagenⅢ的含量明显增加（P＜0.01）；与模型组比较，生脉散组、厄贝沙坦组大鼠心肌中collagenⅠ、collagenⅢ的含量显著减少（P＜0.01）

表2 各组大鼠collagenⅠ、collagenⅢ表达水平比较（ng∕mg，±s）

表2 各组大鼠collagenⅠ、collagenⅢ表达水平比较（ng∕mg，±s）

组别对照组模型组生脉散低剂量组生脉散高剂量组厄贝沙坦组n 10 10 10 10 10 collagenⅠ0.33±0.15 1.22±0.25△0.80±0.14**0.63±0.04*0.60±0.02*collagenⅢ0.19±0.02 0.80±0.03△0.45±0.05*0.32±0.06*0.30±0.04*

2.6 各组大鼠心肌TGF-β1、Smads3和p-Smad3蛋白表达比较 见图4。模型组大鼠心肌组织中TGF-β1和p-Smad3蛋白表达水平均显著上调（均P＜0.01）；与模型组比较，生脉散高剂量组和厄贝沙坦组大鼠心肌组织中TGF-β1和p-Smad3蛋白表达水平均显著下调（均P＜0.05）。

图4 各组大鼠TGF-β1、Smads3的蛋白表达

3 讨 论

心力衰竭是一组复杂的临床综合征，根据其临床表现及特征，可归属中医学“喘证”“痰饮”“心悸”“心胀”等范畴。《灵枢·胀论》言“心胀者、烦心、短气、卧不安”。心胀日久则耗伤心气、心阴，出现短气、烦心，严重者则不得安卧。当代诸多医家认为其病机为本虚标实、虚实夹杂，本虚为心气虚，标实为瘀血、水饮停留。心气亏损是心阴不足和瘀血内生的根源。气虚则无以行血、阴虚则脉络不利，心气不足无以推动血行，阴虚筋脉失养，血行瘀滞，不荣则痛。故当益气养阴。生脉散始于金代张元素的《医学启源》，由人参、麦冬、五味子组成。方中人参味甘微寒，益元气，补肺气，生津液，用以为君；麦冬甘寒，养阴清热，润肺生津，是为臣药。人参、麦冬合用，增强益气养阴之用，佐以五味子味酸，性甘微温，收敛心气而生津。三药合用，补、润、敛同调，使气复津生，汗止阴存，气充脉复，故曰“生脉”。现代药理学研究表明，生脉散有多重药理活性，包括增强心肌收缩力、防止心室重构等，常用于心律失常、心力衰竭等心血管疾病的防治［10］。厄贝沙坦作为血管紧张素受体拮抗剂类的降压药物，临床试验表明厄贝沙坦能够减轻心脏负担，减少心肌耗氧量，改善心室重塑，促进心功能的恢复［11］。故选用厄贝沙坦为阳性对照药。

各种病理性刺激引起的压力负荷（如高血压、主动脉狭窄）通过信号通路转导，能够引起心肌细胞的肥大，表现为心室壁的增厚和心室收缩功能的增强［12］。胸主动脉弓缩窄术致心力衰竭模型是通过增加心脏的压力负荷从而产生明显的心室肥厚和心室重构。本实验采用主动脉弓缩窄术建立大鼠心力衰竭模型，与对照组相比，TAC术后8周超声观察模型组大鼠心功能指标LVIDd、LVIDs明显升高；LVEF、LVFS明显降低。与对照组比较，HE染色见心肌细胞肥大，提示TAC术后4周即已形成心肌纤维化和心力衰竭，动物模型造模成功。同时生脉散可以减轻模型组大鼠心力衰竭的程度，降低LVIDd、LVIDS，升高LVEF、LVFS的比值。表明心力衰竭时心肌纤维化程度与心功能存在明显的相关性。

现代研究表明，以神经内分泌为主多种因素参与的心室重构是心力衰竭发生、发展的主要病理生理机制，而心肌纤维化是其重要的病理学基础［13］。心肌纤维化是指心肌间质中出现胶原纤维过度沉积、纤维蛋白增生等为特征的心肌间质重构，是心室重构的重要表现形式之一［14］。在心衰过程中，模型组心肌纤维肥大、排列不规整、大量胶原沉积，引起心肌顺应性下降、僵硬度增加，心脏的收缩及舒张功能减退，生脉散干预能够改善心衰大鼠心肌细胞外基质内的胶原异常沉积，进而能够改善心肌重塑。Col-Ⅰ和Col-Ⅲ是心肌细胞外基质中主要的两种胶原蛋白，心衰大鼠心肌中Col-Ⅰ和Col-Ⅲ的含量明显增加，而生脉散干预后Col-Ⅰ、Col-Ⅲ胶原含量均明显减少。结果表明心力衰竭病程中存在明显的心肌纤维化。

TGF-β1∕Smads信号通路是参与心肌纤维化的关键通路，可通过调节Smads蛋白家族成员相互作用介导心肌纤维化发生［15］。Smad3是TGF-β1下游受体的作用靶点，刺激TGF-β1可诱导Smad3活化，进而调控促纤维化基因的表达［16］。本研究中模型组可见TGF-β1、p-Smad3蛋白表达升高，提示TGF-β1∕Smad3通路蛋白的表达可能与心肌纤维化相关。经过生脉散治疗后两者均明显降低，提示生脉散可能通过抑制TGF-β1∕Smad3信号通路活化，进而抑制肌成纤维细胞增殖，达到抑制心肌纤维化、心脏重构的目的。

综上所述，生脉散能够改善心衰大鼠的心功能，减轻心肌纤维化，从而防治心衰后心肌重塑的发生，其机制可能与抑制TGF-β1∕Smads通路有关。