肩袖损伤患者肌腱和骨组织中氧化应激状态及Beclin1、mTOR的表达分析

刘治军，刘少津，郑维蓬，魏合伟*，廖志浩，陈胜

(1.广州中医药大学第三附属医院运动医学科，广东 广州 510240；2.广东省中医院运动医学科，广东 广州 510115)

肩袖损伤是人体常见的运动系统疾病，可由外伤、退行性等因素导致。在美国，每年大约有450万人因肩痛就诊，其中约25万人接受了肩袖手术的治疗[1]。在中国，随着人口老龄化趋势和全民健身普及，肩袖损伤的发病率和就医率也在逐步上升。氧化应激是机体促氧化与抗氧化失衡，产生自由基增多、组织器官抗氧化能力下降的一种病理状态，它可导致创面损害，不利于愈合[2]。自噬是一种动态的分解代谢过程，与细胞损伤、修复、增殖等密切相关，在细胞应激和环境适应中起重要作用[3]。自噬在一定程度上具有抵抗细胞凋亡的作用，但是也并非都是积极保护作用，过度或不足的自噬都能损伤细胞，甚至可致细胞死亡[4]。在临床中发现损伤后的肩袖往往无法自行愈合，甚至撕裂严重导致其他结构损伤。即使通过关节镜手术治疗，修复后的肩袖也往往因腱骨愈合不良容易再发撕裂。因此，本研究通过观察肩袖损伤发生时肌腱和肩袖止点足印区骨组织中氧化应激反应及Beclin1、雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)差异表达情况，来探讨氧化应激和自噬对腱-骨愈合的作用。

1 材料和方法

1.1 实验材料 选择2019年7月至2020年12月广州中医药大学第三附属医院符合肩袖损伤诊断标准[5]的20例患者，男10例，女10例；年龄30～75岁，平均(61.52±7.32)岁。全部患者均行肩关节镜下肩袖锚钉修补术，术中提取患者损伤的肌腱组织和肩袖止点足印区骨组织样本为损伤组，取正常的肌腱组织和足印区旁骨组织样本为对照组。获得肌腱和骨组织样本的方案已得到广州中医药大学第三附属医院研究伦理委员会的批准(中国广州)，并签署知情同意书。本试验研究经中国临床试验注册中心注册，注册号为ChiCTR-2000033948。各组患者临床特征之间没有差异，包括年龄、体重指数、性别、糖尿病、高血压和外周动脉疾病。所有处理过的肌腱和骨组织标本均使用液氮冷冻，保存备用。

TRIzol试剂(批号：DP424，北京天根生化)，0.25%胰蛋白酶(批号：15050065，Gibco)，Dulbecco氏培养基(Dulbecoo's modified eagle medium，DMEM)(批号：11965092，Gibco)，cDNA合成试剂盒(批号：KR118，北京天根生化)，逆转录聚合酶链式反应(reverse transcriotion-polymerase chain reaction，RT-PCR)试剂盒(批号：QP002，广州复能基因)，组织活性氧(reactive oxygen species，ROS)检测试剂盒(批号：BB-470532，贝博生物)，超氧化物检测试剂盒(批号：S0060，碧云天)，Beclin-1(D40C5)Rabbit mAb(批号：3495T，CST)，mTOR(7C10)Rabbit mAb(批号：2983T，CST)，P-mTOR(Ser2448)(D9C2)Rabbit(批号：5536T，CST)，聚氰基丙烯酸正丁酯(butyleyanoacrylate，BCA)蛋白浓度测定试剂盒(批号：P0012，碧云天)，电化学发光(electro-chemi luminescence，ECL)液(批号：P0018S，碧云天)。离心机(型号：ST16，Thermo Fisher公司)，RT-PCR仪(型号：7500，ABI)，核酸微量分析仪，多功能酶标仪。

1.2 实验方法

1.2.1 ROS检测 从液氮中取出保存的各组肌腱和骨组织临床标本，解冻后用磷酸盐缓冲液(phosphate buffered solution，PBS)洗净，准确称取50 mg组织，加入1 mL匀浆缓冲液A，用玻璃匀浆器充分匀浆；1 000转/min 4 ℃离心10 min，弃沉淀，取上清。采用ROS检测试剂盒(贝博，BB-470532)检测组织中ROS水平，用2'，7'-二氯二氢荧光素二乙酸酯(2'，7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate，DCFH-DA)法检测肌腱和骨组织样本中的总ROS水平。主要方法为：在96孔板中加入190 μL匀浆上清液、10 μL O12探针，用移液器吹打，使之重复混匀；在37 ℃避光孵育15～30 min；置于酶标仪中，后于激发波长为488 nm、发射波长526 nm检测荧光强度；活性氧水平计算公式：相对荧光强度=(荧光强度样品1-荧光强度空白对照)/(荧光强度样品n-荧光强度空白对照)×100%。

1.2.2 组织超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)检测 准确称取50 mg组织，放进15 mL锥形离心管。加3 mL GENMED清理液(Reagent A)清洗1次。切碎组织，放进预冷的15 mL锥形离心管。加入250 μL预冷的GENMED裂解液(Reagent B)。震荡5 s，充分混匀。放进预冷的dounce匀浆器。匀浆棒匀化组织，匀浆物移入1.5 mL离心管，移取10 μL进行蛋白定量检测。另取10 μL上清匀浆液，用PBS大约稀释5倍，取20 μL进行蛋白定量。采用组织超氧阴离子检测试剂盒(GENME，GMS10096.2 v.A)，用二氢乙锭(dihydroethidium，DHE)法检测SOD含量。按照说明检测组织中超氧阴离子水平：96孔板每孔加入100 μL组织上清和100 μL超氧化物检测工作液，37 ℃孵育3 min。加入可以诱导产生超氧化物的刺激物，如丙二酸甲醚醋酸酯等，刺激30 min。在450 nm测定吸光度。移取50 μL GENMED缓冲液(Reagent C)到空白对照孔，移取50 μL上述准备的待测样品到待测样品孔里。分别加入50μL GENMED染色液(Reagent D)。混匀，37 ℃培养箱里孵育30 min，离心，抽去上清液，分别加入100 μL GENMED溶解液(Reagent E)，混匀。孵育5 min，放进酶标仪里测读：获得吸光读数(OD)。构建生成曲线：纵座标(Y轴)为吸光值(OD)；横坐标(X轴)为组织量、时间点或药物处理浓度等。计算样本浓度：[(样品读数-背景读数)×0.1 mL(体系容量)×样品稀释倍数]÷[0.05 mL(样品容量)×20 μmol(吸光系数)× 0.6 cm(光径距离)]=μmol/mL÷(样品蛋白浓度) mg/mL=μmol/mg。

1.2.3 RT-PCR检测Beclin1和mTOR mRNA的表达 取出液氮保存的各组临床标本，解冻后用PBS洗净。准确称取50 mg组织，加入1 mL TRIzol，根据试剂盒说明书提取总RNA。于PCR仪上70℃保温5 min，迅速置冰上冷却。依次加入4 μL 5×buffer，2 μL 10 mmol脱氧核糖核苷三磷酸(deoxy-ribonucleoside triphosphate，dNTP)，1 μL RNA inhibitor和1 μL 反转录酶，混匀。于PCR仪上42 ℃保温30 min，结束后80 ℃保温5 min灭活反转录酶，RT-PCR反应，10 μL体系，反应条件：95 ℃ 10 min，95 ℃ 10 s，55 ℃ 20 s GOTO 39(40个循环)，72 ℃ 35 s。循环结束后从55 ℃升高到95 ℃获取熔解曲线。用其系统软件进行实验结果分析：2-ΔΔCt法A=Ct(目的基因，待测样本)-Ct(内标基因，待测样本)；B=Ct(目的基因，对照样本)-Ct(内标基因，对照样本)K=A-B；表达倍数=2-K。 各基因引物序列见表1。

表1 RT-PCR引物序列

1.2.4 免疫蛋白印迹(western blot，WB)检测Beclin1、p-mTOR/mTOR蛋白 取出液氮保存的各组临床标本，解冻，PBS洗净。准确称取100 mg组织，加入0.1 mL裂解液，匀浆。4 ℃，12 000 g离心5 min，收集上清，即为总蛋白溶液。用PBS完全溶解标准品，使终浓度为0.5 mg/mL。根据标准曲线计算出样品蛋白浓度。上样电泳，转膜。室温下用5%的脱脂牛奶[0.5% TBST(TBS+Tween)配]，封闭1 h；稀释一抗[TBST溶解的5%脱脂牛奶，磷酸化蛋白使用TBST溶解的5%牛血清白蛋白(bovine albumin，BSA)]，4 ℃过夜；稀释二抗(TBST溶解的5%脱脂牛奶)，室温下孵育30 min后，用TBST洗3次，每次5 min。将A和B两种试剂等体积混合，将膜蛋白面朝上与此混合液充分接触，包好，暗匣中曝光。最后用显影、定影试剂进行显影和定影；根据不同的光强度调整曝光条件。将胶片进行扫描存档，ImageJ软件处理系统分析目标带的光密度值。

2 实验结果

2.1 肌腱和骨组织ROS水平比较 与对照组比较，损伤组的肌腱和骨组织中ROS水平显著升高(P<0.05)。表明肩袖损伤时肌腱和骨组织中活性氧含量增加(见图1)。

图1 两组肌腱和骨组织ROS水平比较

2.2 肌腱和骨组织SOD含量比较 与对照组比较，损伤组的肌腱组织中SOD水平显著降低(P<0.05)，而足印区骨组织中SOD水平显著升高(P<0.05)。表明肩袖损伤时肩袖组织中SOD含量降低，而骨组织中含量升高(见图2)。

图2 两组肌腱和骨组织中SOD含量比较

2.3 肌腱和骨组织中Beclin1、mTOR mRNA水平比较 PT-PCR检测肩袖损伤患者肌腱和骨组织中Beclin1、mTOR mRNA水平，与对照组比较，损伤组的肌腱和骨组织中Beclin1mRNA表达显著升高(P<0.05)，mTOR mRNA表达显著降低(P<0.05，见图3)。

图3 两组肌腱和骨组织中Beclin1、mTOR mRNA水平比较

2.4 肌腱和骨组织中Beclin1、p-mTOR/mTOR蛋白水平比较 WB检测肩袖损伤患者肌腱和骨组织中Beclin1、p-mTOR/mTOR蛋白水平，与对照组比较，损伤组的肌腱和骨组织中Beclin1蛋白表达显著升高(P<0.05)，p-mTOR蛋白表达显著降低(P<0.05)，mTOR蛋白表达升高不明显(见图4～5)。

图4 两组肌腱和骨组织中Beclin1、p-mTOR/mTOR蛋白水平

图5 两组肌腱和骨组织中Beclin1、p-mTOR/mTOR蛋白电泳图

3 讨 论

肩袖的肌肉在维持正常盂肱运动和稳定性中起着重要作用。冈上肌用于启动外展，冈下肌和小圆肌负责外旋，而肩胛下肌是肩部的主要内旋肌[6-7]。肩袖撕裂代表了一种常见的肩部病变，是肩部疼痛、活动受限的常见原因，不同年龄段人群其临床症状表现不一。通常情况下，肩袖撕裂在老年人中比在年轻患者中更常见，其具有慢性或急性-慢性病程，并且通常继发于肌腱变性[8]。肌腱是将肌肉与骨骼连接起来的纤维结缔组织，它们的主要功能是在运动过程中将力从相应的肌肉传递到骨骼，因此，它们经常承受机械载荷。过度使用造成的肌腱损伤会导致疼痛和运动障碍，并可能发展为骨关节炎和残疾[9]。肩袖修复术是治疗肩袖损伤常用的手段，能有效缓解肩部疼痛、活动受限，但术后康复时间较长、且肩袖发生再撕裂的概率很高，其主要原因在于术后肩袖止点处腱-骨愈合较差，难以恢复原有的组织学结构特性和生物力学性能[10-11]。因此，如何有效提高肩袖止点处的腱-骨愈合是解决此类问题的关键。

肩袖损伤是一种比较常见的肌腱病，也是一种慢性活动受限综合征，其特征是与活动相关的疼痛、肿胀或功能障碍。过度使用或衰老导致的肌腱损伤是目前临床治疗上的巨大挑战，因为受损肌腱组织的自我修复非常缓慢且不完全。肌腱分化的分子机制很大程度上是不确定的，从而阻碍了肌腱修复新疗法的发展[11]。在生理条件下，机体不断产生活性氧，机体的抗氧化系统不断清除活性氧，处于动态平衡状态，不会对机体造成伤害[12]。然而，当有害刺激发生时，会产生大量活性氧，而抗氧化系统去除这些活性氧的能力有限，最终导致氧化损伤[13]。众所周知，机械性超负荷会在肌腱细胞中诱导细胞应激，例如氧化应激和内质网应激，从而导致肌腱炎和肌腱变性[14]。在肌腱的退行性改变过程中，线粒体的功能障碍将导致ROS的过度增加，而ROS的过度产生引起的氧化应激将在肌腱的退变过程中发挥至关重要的作用，造成持续的肌腱功能丧失[15]。自噬是一种自然的破坏性机制，可以使功能异常的细胞组分有序降解和再循环。自噬被各种内在和外在的细胞应激激活，例如饥饿、ROS积累和缺氧，并且在这些应激条件下维持细胞稳态方面起着至关重要的作用[16-17]。mTOR和Beclin1都有介导自噬发生的作用，是自噬调控的重要因子，并形成Beclin1-mTOR交互调控网络，在Beclin1调节自噬的网络功能中，与mTOR细胞信号传导通道之间存在的相互反馈调控机制[18-20]。本研究检测了在临床中收集的正常肩袖和受损肩袖组织、足印区和非足印区骨组织中的ROS、SOD水平，发现受损肩袖组织中ROS水平升高、SOD降低，而足印区骨组织中ROS、SOD表达水平都升高，表明受损的肌腱和足印区坏死的骨组织受到有害刺激后，影响了ROS、SOD的含量，激发了氧化应激反应。进而检测了Beclin1、mTOR的表达含量，发现受损肩袖组织和足印区骨组织中Beclin1表达含量较高，而mTOR表达含量较低，说明Beclin1在调节自噬过程中与mTOR细胞信号传导之间存在相互反馈调控机制；也表明由于ROS、SOD的过度积累，在氧化应激的条件下，诱导细胞产生自噬促进腱-骨愈合，以免受氧化应激造成的损害。

综上所述，损伤的肌腱和足印区坏死的骨组织受到有害刺激后，导致ROS、SOD过度积累的微环境使细胞遭受强烈的氧化应激。与此同时，出于维持细胞稳态的作用，在氧化应激的条件下，诱导细胞产生自噬促进腱-骨愈合，以免受氧化应激造成的损害。其氧化应激和自噬具体通过何种途径、机制来影响腱-骨愈合，仍需要进一步深入探讨。