生物保护菌联合气调包装应用于肉品中抑菌保鲜的研究进展

马 静，张 潮，刘 骞，陈 倩，孔保华*

（东北农业大学食品学院，黑龙江 哈尔滨 150030）

随着生活水平的提高，消费者对于肉类食品的需求量日益增加。截止到2020年，我国城镇人口人均肉类消费量达27.4 kg，农村人口人均肉类消费量达21.4 kg，全国居民人均肉类消费量达24.8 kg[1]，由此可见，肉类食品在人们的饮食中占据着重要地位。然而，由于肉及肉制品中营养物质丰富、水分含量较高，容易导致其在加工、运输及销售过程中滋生腐败菌，引发肉品腐败变质，从而影响肉的食用安全性及货架期[2]。一些研究表明，迷迭香和甘草等混合植物香料作为天然防腐剂对肉类中常见的腐败菌和致病菌（单核细胞增生李斯特氏菌、大肠杆菌、荧光假单胞菌）等具有良好的抑菌效果[3]。但植物香料的添加通常会影响肉品的风味、颜色和口感，这会降低消费者对此类肉品的选择。部分生产商也会采用真空包装或者添加化学防腐剂的方式来延长肉品保质期。虽然真空包装可以在一定程度上延长肉品保质期，但真空条件也会影响肉色，并加剧肉品汁液损失，从而降低肉品营养价值。化学防腐剂对人体可能具有潜在的毒性，因此会引发一定的安全问题。由于目前肉及肉制品的保鲜方式种类多样，保鲜效果也参差不齐[4]，因此，科学、合理地选用保鲜方式至关重要。气调包装是目前采用较多的一种保鲜技术，其是指在一定的温度条件下，向高阻隔性的材料（塑料托盘和封盖膜）内充入O2、N2、CO2等混合气体的物理保鲜技术。气调包装改变了产品所处的环境，同时也阻碍了外界空气的进入，这可以更好地抑制微生物生长并延缓酶促反应，从而延长产品货架期。生物保护菌是指可以添加到食品中的、延长食品货架期、抑制致病菌生长的活的微生物，气调包装和生物保护菌皆具有安全、环保的特点，将其联合应用于肉品中可达到比较理想的抑菌防腐效果[5]。因此，本文主要介绍气调包装常用气体和生物保护菌的抑菌机理，以及二者联合在肉品中的应用，以期为生物保护菌联合气调包装的保鲜方法在食品科学领域的应用提供理论参考。

1 气调包装的常用气体

气调包装是一种利用气体保鲜的物理技术，常用的填充气体主要有O2、N2、CO2和CO等[6]。填充气体的种类和比例会影响肉及肉制品的色泽、口感、微生物数量和种类以及货架期。

肉品的颜色可以反映肉质的好坏，影响消费者的购买欲[7]。肌红蛋白是影响肉类颜色的主要蛋白质[7]。在O2存在条件下，肌红蛋白易与O2结合形成氧合肌红蛋白，使得肉品表面呈现出相较于原来更深的红色。然而过高的O2浓度则会导致肌红蛋白过度氧化而呈现令人不悦的褐色。因此，适合的O2含量可以更好地维持肉品的视觉新鲜度[8]。Bassey等[9]研究气调包装猪里脊肉冷藏过程中品质特性的变化。结果发现，与对照组相比，在含有70% O2的气调包装中猪肉具有较高红度值。Esmer等[8]研究不同O2含量对冷藏条件下碎牛肉色泽的影响。结果表明，与对照组相比，50% O2/30% CO2/20% N2的气体比例可以更好地维持牛肉色泽的稳定性。以上结果表明，在气调包装中，O2比例居于主导地位可以更好地保护肉品色泽。Spanos等[10]研究经过气调包装后零售冷鲜肉中蛋白质和脂质的氧化程度。结果发现，在包装内填充50% O2有助于维持猪肉中脂质和蛋白质的稳定性。因此，适当的O2比例不仅可以更好地维持肉品视觉新鲜度，而且还能够有效维持肉品长时间运输和销售中脂质和蛋白质稳定性，从而更好地延长肉品货架期。

N2是一种惰性气体，性质比较稳定，常被用作气调包装的缓冲气体。N2不会对肉的色泽产生负面影响，也不易被肉吸收，可抑制腐败微生物的生长繁殖，延缓肉的腐败进程。Bassey等[9]发现，与对照组相比，70% N2/30% CO2处理组显著抑制了总活菌数和嗜冷菌数的增长，进而延缓了肉品的腐败变质。

CO2易溶于水和油脂形成碳酸，使肉的pH值降低。较低的pH值可以有效抑制绝大部分微生物的繁殖，进而延长肉的保质期[11]。Yang Jun等[12]研究气调包装中CO2的存在对冷藏期牛肉中微生物种类和数量的影响。结果发现，经过气调包装（50% O2/40% CO2/10% N2；对照组：50% O2/50% N2）处理后牛肉中的微生物多样性随着贮藏时间的延长均呈现降低趋势，同时CO2的存在明显抑制了影响牛肉品质的腐败菌生长。Zhang Xinxiao等[13]研究不同CO2浓度对黄羽鸡冷藏期微生物数量和品质特性的影响，样品分别置于空气（4 ℃）、80% CO2气调包装和30% CO2气调包装条件下进行贮藏实验。结果发现，对照样品、80% CO2气调包装样品和30% CO2气调包装样品的总活菌数分别在贮藏4、10、8 d后达到7.0（lg（CFU/g））；结合其他理化指标和感官评价认为，高含量的CO2气调包装可将鸡肉保质期延长至少6 d。以上结果表明，提高CO2含量可有效减少冷藏期间肉品中微生物的数量和种类。

CO可与肌红蛋白结合形成鲜亮的樱桃红色，以改善肉的色泽，且CO还具有一定的抑菌效果[14]，尤其是对假单胞菌具有很好的抑制作用。但因CO具有一定的毒性，因此一些国家不允许在气调包装内添加CO。挪威肉类专家按照有毒气体检测的国际标准对气调冷却肉中使用CO气体的毒性进行检测后得出结论：低浓度CO（0.5%～1.0%）对消费者的危害可忽略不计[15]。

此外，惰性稀有气体（氦气、氩气、氙气、氖气）也可作为气调包装中的填充气体[16]。Claudia等[17]根据感官分析发现，含有70%氩气的气调包装抑制了香肠中微生物的生长和繁殖，同时可将香肠保质期延长28 d。

在肉品中使用气调包装进行保鲜虽然可以在一定程度上延长货架期，但仍存在一些缺点。例如，气调包装对所使用包装材料的密封性有严格要求。如果包装材料密封性出现问题，则容易导致内部气体溢出，或者外界腐败微生物进入，从而影响肉及肉制品的安全性和保质期。因此，利用生物保护菌对肉品进行保鲜就显得尤为重要[18]。

2 生物保护菌的抑菌机理

生物保护菌作为一种天然、安全、高效的生物防腐剂可以有效抑制有害微生物的生长[2]。生物保护菌的主要作用机制是通过有益菌种产生的有机酸或细菌素来增加微生物细胞膜的通透性，进而抑制其生长[19-20]。此外，生物保护菌还可以通过微生物群体感应作用来抑制有害微生物的生长和生物膜的形成[21]，同时其也会与有害微生物产生竞争，来抑制有害微生物的生长繁殖[20]。目前，在食品保鲜中最常用的生物保护菌是乳酸菌。研究表明，在冷藏温度下，乳酸菌对新鲜牛肉、猪肉、家禽和鱼肉等食品中的腐败细菌和病原体的生长具有良好的拮抗作用[18]。

2.1 有机酸类物质抑菌

乳酸菌在代谢过程中会产生乙酸、乳酸、柠檬酸等有机酸，这些酸性物质具有一定的抑菌杀菌作用[22]，特别是对食品中的大肠杆菌和单核细胞增生李斯特氏菌[23]。乙酸与乳酸均为主要的抑菌物质，其中乙酸对霉菌可以起到较强的抑制作用。Trzaska等[24]证实了乙酸对霉菌具有抑菌和杀菌特性，其中体积分数0.3%乙酸能够有效抑制孢子的萌发和真菌生长。乳酸可以更好地抑制有害微生物的生长，起到延长食品保质期的作用[25-26]。而柠檬酸可杀灭细菌芽孢，降低微生物的抗热性，这有助于有效抑菌和杀菌[27]。有机酸的抑菌机制主要分为以下几种。

2.1.1 能量竞争和提高胞内渗透压

有机酸一般以解离或未解离的状态存在。其中，未解离的有机酸可以直接通过细胞膜，进入微生物细胞内[28]。有害菌体细胞内环境偏碱性，这有助于有机酸解离产生更多氢离子和酸根离子。然而，酸根离子的产生会导致细胞内渗透压增高。为了使胞内胞外渗透压达到平衡，胞内的酸根离子会释放到胞外。但是酸根离子不能通过自由扩散的方式通过细胞膜排出体外[29]，需要以消耗ATP的方式运输到胞外。这加剧了有害菌能量的消耗，同时也会抑制有害菌正常代谢，从而减缓其生长繁殖[30]。此外，在向细胞外释放酸根离子时也可能会将有害菌所需的前体物质及辅助因子一同转移到细胞外，从而致使细菌生长受到抑制[31]。而有害菌胞内过多的离子流失会致使大量钾离子泵入到胞内，从而增加胞内渗透压，致使有害菌细胞膜破裂，内容物流出，最终抑制有害菌的生长[32]。

2.1.2 破坏细菌细胞膜

有机酸易与有害菌细胞膜上的脂类多糖反应，这会破坏有害菌细胞膜结构，降低细胞膜的稳定性[32]，增加细胞膜的通透性，破坏细胞膜的物质跨膜运输，同时也会使得菌体内容物流出，进而起到抑菌杀菌作用[20]。

2.1.3 抑制大分子物质的合成

有机酸还可以通过干扰有害菌体内生物酶系的合成来影响其DNA的复制，从而抑制有害菌生长繁殖，最终达到抑菌效果[25]。Rasch[33]研究指出，罗伊氏乳杆菌产生的有机酸可抑制DNA合成中第1步反应所需的核糖核酸还原酶活性，从而干扰有害菌DNA复制，抑制其生长。

2.2 细菌素类物质抑菌

细菌素是细菌在代谢过程中由核糖体合成的具有杀菌效果的多肽或蛋白质类抗菌物质[20]，其具有抗食源性致病菌和食品腐败菌的特性，可以作为天然、无毒的抗菌剂[34]。细菌素会破坏革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌细胞膜（壁）的通透性和完整性，促使细胞内容物流失，进而影响有害菌代谢和生长[35]，最终致使其死亡。例如，经细菌素A32处理后的大肠杆菌表面会变得粗糙，当细菌素A32浓度升高时，菌体细胞会发生严重破裂，同时有明显的孔洞形成。同理，用细菌素A32处理金黄色葡萄球菌后也会在其表面发现类似的现象[35]。细菌素主要分为Ⅰ类羊毛硫细菌素、Ⅱ类肽类细菌素和Ⅲ类热敏感大分子蛋白三大类[36]。

2.2.1 Ⅰ类羊毛硫细菌素

羊毛硫细菌素中研究最多的是乳酸链球菌素（nisin）[36]。Nisin是由乳酸链球菌产生的一类含有阳离子的多肽，是目前世界上唯一被允许用作食品添加剂的细菌素[37]。Nisin对革兰氏阳性菌和芽孢杆菌的孢子均具有强烈的抑制作用，Nisin在与冷冻、加热、低pH值、乙二胺四乙酸及表面活性剂处理结合后也能够对部分革兰氏阴性菌起到致死作用[38]。在天然状态下，Nisin有Nisin A和Nisin Z 2 种形式，后者的抑菌能力比前者强[39]。Nisin的抑菌机理是通过破坏有害菌细胞膜的完整性，以达到抑菌杀菌的作用。El-Kazzaz等[40]利用Nisin与常用抗生素氨苄青霉素和氯霉素共同抑制致病菌耐万古霉素肠球菌时发现，添加Nisin会极大增强抗生素的杀菌活性，且耐万古霉素肠球菌没有对抗生素产生耐药性，这表明Nisin和氨苄青霉素和氯霉素之间可以协同抑制致病菌的生长繁殖。这主要是因为Nisin会破坏有害菌的细胞膜，致使细菌细胞膜表面产生孔洞，从而导致有害菌内容物流出。同时，孔洞的形成也会促使更多抗生素快速进入细菌菌体内部，从而加速有害菌的凋亡[41]。Nisin的另一种抑菌机制是通过阻碍细胞壁的合成抑制有害菌生长，其主要会与有害菌细胞膜上的脂质Ⅱ发生相互作用，这使得脂质Ⅱ合成细胞壁的前体物质肽聚糖受阻，从而阻碍有害菌细胞壁的形成，抑制菌体繁殖[42]。

2.2.2 Ⅱ类肽类细菌素

Ⅱ类肽类细菌素可分为4 类：乳酸片球菌素、具有抗菌活性络合物的双肽细菌素、环状细菌素和非片球菌素单一线性肽细菌素。Ⅱ类肽类细菌素的抑菌方式与Ⅰ类羊毛硫细菌素相似，主要是通过破坏细胞膜造成细胞质流失的方式来抑制细菌生长。例如，由植物乳杆菌TN635产生的乳酸片球菌素C端的α螺旋可以和有害菌细胞膜表面结合，增加胞体通透性，最终导致内容物流出，细菌凋亡[43]。研究表明，乳酸片球菌素对单核细胞增生李斯特氏菌具有良好的抑制作用[44]。双肽类细菌素一般分为Lactococcin G和Thm B 2 类，其主要通过2 个不同的肽链相互作用达到抑菌效果。当2 个肽链相互作用时不仅可以抑制有害菌生长繁殖所需的ATP形成，还能够抑制有害菌对氨基酸类营养物质的摄取，从而抑制细菌的生长和繁殖；但是当2 个肽链分开时就不具备抑菌作用[45]。环状细菌素只对革兰氏阳性菌起到一定的抑菌效果[20]。非片球菌素单一线性肽细菌素的抑菌机理与环状细菌素相似，即通过改变有害菌细胞膜的通透性发挥抑菌作用。但是非片球菌素单一线性肽细菌素中的Bactofencin A细菌素除外，其主要通过与有害菌细胞壁上的负电荷反应，扰乱胞内胞外的代谢通路以达到抑菌效果[44,46]。

2.2.3 Ⅲ类热敏感大分子蛋白

Ⅲ类细菌素是一种热敏感大分子蛋白，分子质量一般大于30 kDa，其可以有效抑制革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌的生长[47]。Sun Zhilan等[48]研究发现，卷曲乳杆菌产生的卷曲乳杆菌素Helveticin M可破坏革兰氏阳性菌的细胞壁和革兰氏阴性菌的细胞膜，从而改变细菌细胞膜（壁）的通透性，有效抑制革兰氏阳性菌及革兰氏阴性菌的生长繁殖；此外，卷曲乳杆菌素Helveticin M对肉中易滋生的金黄色葡萄球菌有抑制作用。

2.3 群体感应抑制剂抑菌

群体感应是微生物之间的一种通讯机制，微生物细胞会合成并释放信号分子，通过信号分子的不断积累可以调控并影响微生物相关基因的表达[49]。群体感应抑制剂是一类通过调控微生物群体感应系统来抑制腐败菌的生长或降低其对环境耐受性的物质[20]。因此，通过群体感应抑制剂抑制或阻断细菌之间的群体感应可以起到食品保鲜、延长食品保质期的作用。肉品极易受到金黄色葡萄球菌的污染而发生腐败变质。研究表明，革兰氏阳性菌分泌的自诱导肽类信号分子可以抑制金黄色葡萄球菌群体感应过程，影响其生理状态及基因表达，抑制金黄色葡萄球菌繁殖，从而延长畜禽肉的保质期[50]。

2.4 竞争营养物质抑菌

生物保护菌会与腐败菌竞争生长繁殖所必需的营养物质，从而达到抑制腐败菌生长的目的。这种抑菌机制可以与其他抑菌机制同时发挥作用，延长食品的保质期[51]。Nilsson等[52]将栖鱼肉杆菌和单核细胞增生李斯特氏菌混合培养。结果发现，栖鱼肉杆菌的存在会导致单核细胞增生李斯特氏菌的数量减少，这主要是因为栖鱼肉杆菌会与单核细胞增生李斯特氏菌竞争生长所需的营养物质，从而实现对其的抑制作用。

2.5 产生其他物质抑菌

除上述抑菌方式之外，生物保护菌还可以产生蛋白类物质、胞外多糖、CO2等物质来发挥抑菌作用。研究发现，棒状乳杆菌Si3经酶解作用产生的蛋白类抑菌物质可以借助其疏水基团吸附到酵母菌或霉菌细胞上，从而影响酵母菌或霉菌细胞的生理活动，进而抑制其活性[53]。Wang Ji等[54]研究发现，植物乳杆菌YW32产生的胞外多糖可以有效抑制腐败菌和致病菌生物膜的形成。CO2一方面会使周围形成厌氧环境，抑制需氧微生物的生长繁殖，从而延缓食品腐败进程；另一方面，CO2可通过自由扩散的方式进入有害菌菌体内，从而使细胞内环境的pH值下降，抑制胞内酶活性[55]，减缓细胞代谢，抑制细胞生长。

生物保护菌可以有效抑制肉品中腐败菌的生长繁殖，具有高效、安全、环保的优点，但生物保护菌在维持肉品色泽方面不及气调包装。基于此，将2 种保鲜方式应用于肉品中不仅可以更好地维持视觉新鲜度，还可以有效延长肉品的货架期。

3 生物保护菌联合气调包装在肉品保鲜中的应用

3.1 在畜禽肉保鲜中的应用

目前已有很多关于利用气调包装处理畜禽冷鲜肉的研究，但将气调包装与生物保护菌联合应用于畜禽肉中抑菌保鲜的相关研究并不多。相较于单一处理，联合处理取得了更好的抑菌保鲜效果。Zhang Wenmin等[56]研究植物乳杆菌CICC-6257对不同CO2含量下的气调包装猪肉中单核细胞增生李斯特氏菌生长的影响。结果表明：生物保护菌与气调包装联合应用能降低猪肉中单核细胞增生李斯特氏菌的最大生长率和最大种群密度；同时，联合处理对单核细胞增生李斯特氏菌的抑制能力随着CO2含量的增加而增强，结合其他指标最终筛选出植物乳杆菌CICC-6257在60% CO2含量下的气调包装处理对鲜猪肉的保藏效果最好。Melero等[57]为抑制气调包装鸡肉中单核细胞增生李斯特氏菌和空肠弯曲杆菌等病原菌的生长，将伪星状明串珠菌PCK18和长双歧杆菌SSP分别接种到鸡肉中，然后对接种后的鸡肉进行气调包装和冷藏处理。24 d后发现，接种伪星状明串珠菌PCK18鸡肉中，单核细胞增生李斯特氏菌的数量明显减少，接种长双歧杆菌SSP的鸡肉中空肠弯曲杆菌的数量也明显降低，表明这2 种生物保护菌分别对单核细胞增生李斯特氏菌和空肠弯曲杆菌具有明显的抑制效果。王强[58]将清酒乳杆菌与弯曲乳杆菌接种到熏鸡腿表面后进行气调包装（60% CO2/40% N2），用以评估其生物保护作用。结果表明，清酒乳杆菌和弯曲乳杆菌联合气调包装的抑菌保鲜方式对熏鸡腿的表面颜色、硬度和气味的劣变都有很好抑制作用，它们还可以很好地抑制其他腐败菌的生长，延长熏鸡腿的保藏期。此外，将生物保护菌的产物有机酸类物质直接与气调包装联合也可以很好地抑制肉品中腐败菌的生长繁殖。Gonźalez-Fandos等[59]研究生物保护菌产生的有机酸（乳酸）对于气调包装条件下冷藏（4 ℃）鸡腿中单核细胞增生李斯特氏菌的影响。结果发现，与只经过气调包装的鸡腿相比，20% CO2/80% N2气调包装结合3.75%乳酸和3.75%山梨酸钾处理的鸡腿中单核细胞增生李斯特氏菌的数量显著减少。这表明将生物保护菌的产物有机酸直接与气调包装结合应用于冷藏鸡腿肉具有优良的抑菌前景。Yang Xiaoyin等[60]研究高氧气调包装（20% CO2/80% O2）和含CO的无氧气调包装（0.4% CO/30% CO2/69.6% N2）与生物保护菌结合对冷藏牛排色泽稳定性的影响，牛排冷藏20 d后发现，含CO气调包装的牛排中乳杆菌属和乳球菌属更好地保持了冷藏牛肉的色泽。这为利用生物保护菌结合气调包装的方式来提高肉品的视觉新鲜度提供了一定的理论依据。

3.2 在水产品保鲜中的应用

生物保护菌与气调包装联合应用在水产品防腐抑菌中也发挥了良好的作用。Costa等[61]在气调包装及冷藏条件下，研究萨凯乳杆菌CTC494对金枪鱼片中单核细胞增生李斯特氏菌的影响。结果发现，产酸菌萨凯乳杆菌CTC494对金枪鱼片中腐败菌单核细胞增生李斯特氏菌的生长起到明显抑制作用，同时根据微生物和感官分析结果发现，当萨凯乳杆菌CTC494的接种量为4（lg（CFU/g））时，金枪鱼片的感官质量最好，且此时萨凯乳杆菌CTC494对于单核细胞增生李斯特氏菌抑菌效果最优。

综上所述，生物保护菌联合气调包装的保鲜方法可以更好抑制有害菌的生长，保持肉品的颜色，延长肉品的货架期。

4 结 语

生物保护菌联合气调包装应用于肉品中可以弥补单纯生物保护菌在肉品贮藏中色泽方面的不足[60]，同时也可以填补单纯气调包装在肉品贮藏中某些特殊腐败菌生长的缺口[62]。但是，生物保护菌与气调包装联合处理的方法仍存在一些问题。一方面，肉及肉制品的货架期与其所使用的包装膜材料的阻隔性有一定的相关性[11]。因此，还要探索并改进气调包装的包装材料，使其可以较长时间地维持包装内气体含量和比例不变，从而更好地维持肉品新鲜度[63]。另一方面，已发现可用于抑制有害微生物生长的生物保护菌种类并不多。目前只有Nisin是被允许直接添加到食品中的，而其他生物保护菌的安全性还有待进一步证实[64]。尽管生物保护菌联合气调包装在食品领域仍存在一些问题，但从长远来看，生物保护菌联合气调包装的保鲜方式极具发展潜力。随着更多无毒无害生物保护菌的出现以及气调包装进一步发展，二者的联合很可能成为食品运输和销售过程中防腐保鲜、延长货架期的重要手段，同时也会为其他食品的保鲜方式提供参考与借鉴。