基于Illumina MiSeq高通量测序技术内蒙古巴彦淖尔市酸粥真菌菌群多样性分析

张 青，付 华，苏 靖，夏美茹

（河套学院 农学系，内蒙古 巴彦淖尔 015000）

酸粥作为我国山西、陕西和内蒙古部分地区的传统发酵型谷物食品，主要利用乳酸菌和酵母菌等微生物对糜米等谷物进行发酵而成，因其具有良好风味、营养价值及保健作用而得到消费者的喜欢[1]。研究显示，谷物经过发酵后其营养价值有明显提高[2]，酸粥也因此受到了研究者较多的关注。张悦等[3]采用响应面法对酸粥的制作工艺进行优化，结果发现，在32 ℃发酵20 h，并将酸浆稀释5倍后的酸粥感官品质最优；任宇婷等[4]对广西扶绥酸粥的营养成分和微生物类群展开了研究，结果发现，扶绥酸粥中富含维生素和游离氨基酸，且乳酸杆菌属（Lactobacillus）和毕赤酵母属（Pichia）分别为其中主要的优势细菌属和真菌属。然而，目前针对酸粥细菌菌群的研究更加广泛而深入[5]，对真菌类群的研究相对较少。与此同时，酸粥的制作还未实现工业化生产，仍依靠家庭作坊式制作[6]。

位于内蒙古河套地区的巴彦淖尔市具有广泛制作和食用酸粥的习俗，酸粥亦是当地的一种特色名小吃，然而目前针对当地酸粥的真菌类群解析还鲜有报道。因而，解析巴彦淖尔地区酸粥的真菌类群对全面了解酸粥的微生物类群以及未来酸粥工业化生产用菌的选择具有一定的积极意义。Illumina MiSeq高通量测序技术作为第二代高通量测序技术，因其能够满足快速扫描样品环境微生物和价格低廉等需求[7]，被广泛应用于检测环境微生物[8]、肠道微生物[9]和酿酒微生物[10]等，亦是解析发酵食品中微生物类群的有效方法[11]。

为明确内蒙古巴彦淖尔地区酸粥样品中的真菌菌群多样性，本研究采用Illumina MiSeq高通量测序技术对其真菌菌群多样性进行分析，并探讨其中菌群的相关关系，以期为后续以酸粥为典型的地方发酵谷物制品产业发展给予理论数据支持。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 材料

8份酸粥样品：均采集自内蒙古自治区巴彦淖尔市8个地区/县/旗当地农户自制的自然发酵酸粥，8份样品编号依次为BS1～BS8，将采集到的样品分别装入采样瓶中并放于有冰盒的采样箱后带回实验室进行研究。纳入本研究的所有酸粥样品均以糜米为主要原料，发酵时间在24～48 h。

1.1.2 试剂

MoBio PowerSoil脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）Isolation Kit基因组提取试剂盒：德国QIAGEN公司；Agencourt AMPure XP核酸纯化试剂盒：美国贝克曼库尔特公司；Agilent DNA 1000 Kit：美国Agilent公司。其他试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

ABI Veriti梯度聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）仪：美国ABI公司；BIO-RAD 164-5050基础电源电泳仪：美国伯乐公司；UVPCDS8000凝胶成像分析系统：美国Protein Simple公司；高通量测序平台：美国Illumina公司；R920机架式服务器：美国Dell公司。

1.3 方法

1.3.1 酸粥样品宏基因组提取、PCR扩增和高通量测序

使用基因组DNA提取试剂盒并参照说明书的具体步骤提取酸粥样品中真菌菌群的宏基因组总DNA；以其为模板，采用引物ITS3F（5'-GCATCGATGAAGAACGCAGC-3'）和ITS4R（5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'）对真菌的ITS 1区基因序列进行PCR扩增[12]，PCR扩增体系和程序参照王玉荣等[13]的方法，并对检验后的PCR扩增产物进行质量检测；将检测合格的PCR扩增产物委托南京奥维森生物医药科技有限公司完成MiSeq平台的测序。

1.3.2 数据处理及分析

将反馈回的有效序列上传至QIIME（v1.70）平台以对测序结果进行生物信息学分析[14]。首先将双端序列对齐并归至各样品中，再采用UCLUST法将序列按97%的相似度划分操作分类单元（operational taxonomic units，OTU）[15]，之后对OTU进行嵌合体检查[16]，除去嵌合体OTU，继而使用SILVA数据库[17]对OTU进行分类学注释，最后对酸粥样品中真菌的α多样性指数进行计算[18]，进而对样品的物种丰度及多样性进行评估。

1.3.3 数据处理及分析

使用Origin 2021软件绘制稀释曲线图；使用R软件实现各样品中真菌门和属相对含量的可视化；使用Excel 2016绘制核心优势OTU相对含量的瀑布图；最后使用SAS 9.4软件计算核心OTU的相关性系数和P值，并采用Catyscape（v3.7.2）软件绘制相关性网络图。

2 结果与分析

2.1 高通量测序结果及α多样性分析结果

采用高通量测序技术对酸粥样品中真菌菌群的ITS 1区基因序列进行测序，共得到785 549条序列，按照97%相似度划分序列并删除嵌合体OTU后共划分得到1 752个OTU，平均每个样品获得97 606条有效序列和539个OTU，各样品的测序结果及α多样性分析结果见表1。

表1 8份酸粥样品真菌菌群的高通量测序结果及α多样性分析结果Table 1 Results of high-throughput sequencing and alpha diversity analysis of fungal flora in 8 sour porridge samples

由表1可知，采集自五原县的BS6样品所获得的序列数最多，达213 049条；采集自杭锦后旗的BS7样品所获得的序列数最少，仅有45 353条；BS6样品的OTU数最多，而BS3样品的OTU数最少。选取所有OTU代表性序列比对共鉴定到12个门、21个纲、55个目、119个科和198个属，不能鉴定到门和属的序列数分别占总序列数的0.97%和3.55%。由表1亦可知，所有样品的超1指数范围为453～890，其中BS3样品的超1指数最小，BS6样品的超1指数最大；香农指数范围为1.39～4.81，BS4样品的香农指数最小，BS6样品的香农指数仍最大。超1指数和香农指数的大小分别与物种丰富程度和多样程度成正比，两者的值越大，则物种丰富度及多样程度越高[19-20]。因而较之其他样品，BS6样品中的真菌类群不仅丰度最高，物种多样性亦最高。此外，分析发现8份样品之间的OTU数和α多样性指数之间存在着较大差异，分析原因可能是由于样品采集自不同县市的8户农家，不同的制作手法和制作环境对酸粥中菌群的构成有着直接或间接的影响[21]。

为检查测序结果是否满足后续研究要求，本研究进一步采用稀释曲线和香农指数曲线分析酸粥样品的测序深度和物种多样性，结果见图1。由图1可知，BS6和BS8样品的测序深度较其他样品较深，发现物种数亦较多，BS6和BS7样品的香农指数较高。然而所有样品的稀释曲线与香农曲线却有着相同的变化趋势，稀释曲线均随测序深度的增加而不断上升，而香农指数曲线却是先随测序深度的增加而上升，随后上升速度趋于平缓，在测序深度达到40 000条时进入平台期，表明增加测序深度虽能检测到更多的物种丰度，但物种的多样性却并不会大幅增加，说明在每个样品的测序深度为43 010条序列时，物种的覆盖率高且全面，因此，这一测序深度恰当，其结果能够表现其群落构成的范围，可满足要求并进行后续分析。

图1 酸粥样品的稀疏曲线（A）和香农指数曲线（B）Fig.1 Rarefaction curve (A) and Shannon index curve (B) of sour porridge samples

2.2 酸粥样品真菌菌群结构分析

2.2.1 基于真菌门分类学地位的真菌类群分析

基于门水平解析酸粥样品中的真菌类群构成，结果见图2。

图2 酸粥样品中真菌门的相对丰度分析结果Fig.2 Analysis results of relative abundance of fungal phylum in sour porridge samples

由图2可知，所有样品仅注释到1个优势真菌门（平均相对丰度＞1.0%），为子囊菌门（Ascomycota），其平均相对丰度高达98.11%。可见，酸粥样品中的真菌类群大多隶属于Ascomycota。

2.2.2 基于真菌属分类学地位的真菌类群分析

进一步基于属水平解析酸粥样品中的真菌类群构成，结果见图3。

图3 酸粥样品中真菌属的相对丰度分析结果Fig.3 Analysis results of relative abundance of fungal genus in sour porridge samples

由图3可知，所有样品共鉴定出8个优势真菌属（平均相对丰度＞1.0%），分别为毕赤酵母属（Pichia）（37.32%）、哈萨克斯坦酵母属（Kazachstania）（20.34%）、酵母属（Sac charomyces）（11.03%）、耐碱酵母属（Galactomyces）（9.41%）、假丝酵母属（Candida）（5.88%）、曲霉属（Aspergillus）（4.44%）、伊萨酵母属（Issatchenkia）（2.69%）和德巴利酵母属（Debaryomyces）（1.51%）。可见，酸粥样品中的真菌类群以酵母菌居多，同时亦含有少量的霉菌。上述真菌属在不同地区的酸粥中均有被检测到，但各个菌属的相对丰度在不同地区的样品中有所差异。如王玉荣等[13，22]使用MiSeq高通量测序技术解析内蒙古鄂尔多斯地区酸粥的真菌菌群时发现，假丝酵母属（Candida）和耐碱酵母属（Galactomyccs）为相对丰度最高的两个优势真菌属，而毕赤酵母属（Pichia）相对丰度＜1.0%。此外，折米娜等[23]研究发现，使用乳酸菌和毕赤酵母菌复配发酵的酸粥滋味品质与使用乳酸菌单一发酵的酸粥滋味品质并无显著差异；JESPERSEN L[24]研究发现，酵母菌能够在发酵过程中起到促进乳酸菌生长的作用。因而，毕赤酵母属对酸粥的滋味品质并无积极影响，但或许对酸粥中微生物共生有积极作用。

值得注意的是，这些优势真菌属在各样品中的相对丰度并未像优势真菌门一样表现出均一性。如Pichia在BS1、BS2、BS3和BS8样品中的相对丰度在40.67%～81.13%之间，但在其他样品中相对丰度却＜2.0%；Kazachstania仅在BS4和BS8样品中相对丰度较高，而Galactomyces、Aspergillus和Saccharomyces仅分别在BS5、BS6和BS7样品中较丰富一些。纳入本研究的样品虽都来源于巴彦淖尔市，但该市地理面积广阔，南北中西部分别为平原、草原、山地和沙漠戈壁，地理形势复杂，各县的环境亦有所不同[25]。

2.2.3 基于OTU水平的真菌类群分析

进一步从OTU水平解析酸粥样品中的真菌类群，OTU在各样品中的分布情况见图4。

图4 酸粥样品中操作分类单元数量的分布情况Fig.4 Distribution of operational taxonomic unit quantities in sour porridge samples

由图4可知，在8份酸粥样品中，BS6、BS7和BS8样品较其他样品获得了更多的OTU，其含有的特有OTU（仅在一个样品中存在，其他样品中均不存在的OTU）亦更多，它们各自包含的特有OTU数量均＞150个，而其他样品各自包含的特有OTU却＜50个，说明上述3个样品中的真菌类群较其他样品更为丰富和特别。值得注意的是，8份样品中包含了50个核心OTU（在所有样品中均存在的OTU），本研究选取了其中平均含量＞1.0%的优势OTU进一步分析，结果见图5。

图5 核心操作分类单元相对丰度统计分析结果Fig.5 Results of statistical analysis of relative abundance of core operational taxonomic units

由图5可知，50个核心OTU中共有15个核心OTU，分别被注释为毕赤酵母属（Pichia）（OTU4549和OTU990）、耐碱酵母属（Galactomyces）（OTU2455和OTU1541）、哈萨克斯坦酵母属（Kazachstania）（OTU6240和OTU5763）、假丝酵母属（Candida）（OTU1327）、曲霉属（Aspergillus）（OTU 1949、OTU2129和OTU4506）、伊萨酵母属（Issatchenkia）（OTU5030和OTU185）、德巴利氏酵母属（Debaryomyces）（OTU4366）和酵母属（Saccharomyces）（OTU2585和OTU 2104），累计相对含量分别为37.45%、17.99%、15.04%、5.12%、8.83%、3.00%、1.56%、3.50%，总累计相对含量高达92.49%。该结果与优势菌属得到的结论十分相近，说明虽然部分样品中有着较多不同于其他样品的菌群类别，但整体的核心菌群（相对含量＞1.0%的核心OTU被注释到的真菌属）却都是一致的。

在核心优势OTU分析的基础上，本研究进一步探究它们之间的相关性，结果见图6。由图6可知，核心优势OTU之间更多呈现出负相关关系，但均不具有显著性（P＞0.05）。相反，具有显著相关性的核心优势OTU间均为正相关关系（P＜0.05）。如OTU4549与OTU5030（R=0.973）、OTU2455与OTU1541（R=0.986）和OTU5763（R=0.978）、OTU1541与OTU5763（R=0.999）、OTU1949与OTU2129（R=0.999）和OTU4506（R=0.999）、OTU 2129和OTU（R=0.999）、OTU5030和OTU185（R=0.985）以及OTU2585和OTU2104（R=0.999）之间均为显著正相关关系（P＜0.05）。由此可见，酸粥样品中的真菌类群间可能大多为共存关系，酸粥品质的形成亦可能是它们协同互作的结果。

图6 核心优势操作分类单元间相关性分析结果Fig.6 Results of correlation analysis between core dominant operational taxonomic units

3 结论

使用高通量测序技术对巴彦淖尔地区酸粥样品中的真菌菌群多样性进行研究，结果发现，8份酸粥样品中的优势真菌门为Ascomycota（98.11%），优势真菌属为Pichia（37.32%）、Kazachstania（20.34%）、Saccharomyces（11.03%）、Galactomyces（9.41%）、Candida（5.88%）、Aspergillus（4.44%）、Issatchenkia（2.69%）和Debaryomyces（1.51%），这些菌属也为其中的核心真菌类群，且核心菌群之间大多表现为正相关关系。