芳樟醇体外抗红色毛癣菌活性及机理研究

成福 张秋寒 唐晓莲 王万能

(1.重庆理工大学药学与生物工程学院，重庆 400054；2.重庆大学附属肿瘤医院中国药房编辑出版中心，重庆 400042)

浅部真菌感染(superficial fungal infections，SFIS)是亲角质层的真菌感染引起的皮肤癣病，常见有体癣、足癣、股癣、甲癣、头癣和面癣等，影响了20%～25%的人口[1-3]。皮肤癣菌是一类丝状真菌，其作为SFIS的主要病原体可侵袭感染角质丰富的皮肤、毛发和指甲等部位，从而导致皮肤癣病的发生[4]。研究发现，引起皮肤癣病的菌属主要有毛癣菌属、表皮癣菌属、犬小孢子菌属三类[5]，且约60%的皮肤癣病是由红色毛癣菌感染所致，严重危害人类健康[6]。此外，由于近年来广谱抗生素、皮质类固醇以及免疫抑制剂的广泛使用，临床上的真菌感染率也逐年上升[7-8]。在真菌性侵染引起的皮肤癣病中，烯丙胺类和唑类药品是用于治疗真菌感染的常用药物，但因它们存在不同程度的毒副作用，且由于真菌感染具有高复发性特点，导致当前使用的药物治疗效果降低，难以治愈[9]。此外，目前新的抗真菌药物的开发几近处于停滞状态，而真菌耐药性问题却日渐严重，故开发新型抗真菌药物具有重要意义。芳樟醇是一种不饱和萜烯类物质，广泛存在于天然植物中，具有抗焦虑、抗炎、抗惊厥、抗菌等多种生物活性作用，已被应用于化妆品及食品工业[10]。有研究报道芳樟醇对口腔龋齿等细菌具有抑制作用[11]，并能抑制葡萄球菌、大肠埃希氏菌、变形杆菌、肠炎杆菌、酵母菌、黑曲霉等菌株[12]，具有抑制皮肤癣菌的巨大潜力。本文以芳樟醇为研究对象，探究其对红色毛癣菌的抗菌作用机理，为开发新型抗真菌药物奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

芳樟醇(上海麦克林生化科技有限公司，纯度>97%)；二甲基亚砜(成都市科龙化工试剂厂)；盐酸特比萘芬(大连美仑生物技术公司)；地塞米松注射液(湖北天药药业有限公司)；特比萘芬凝胶(浙江得恩德制药有限公司)；实验用红色毛癣菌为重庆市陆军军医大学大坪医院皮肤科临床分离菌株。

生化培养箱(山东智诚仪器制造有限公司)；立式高温压力灭菌器(制微仪器有限公司)；双目生物显微镜(上海光学仪器厂)；低温冷冻离心机(德国Eppendorf公司)；Hitachi-7500透射电镜(日本日立公司)。

豚鼠(260±20 g)，雌雄各半，购自重庆医科大学实验动物中心，于恒温(24～26℃)、恒湿(45% ～ 65%)条件下进行12 h明暗交替喂养，自由进食及饮水。

沙堡弱葡萄糖琼脂(SDA)培养基：葡萄糖4 g，蛋白胨1 g，琼脂1.8 g，蒸馏水100 mL,pH 7.0，沙堡弱葡萄糖液体培养基(SDB)则不加琼脂。

1.2 方法

芳樟醇抗红色毛癣菌的最小抑菌浓度(MIC)测定 将2.56 mg芳樟醇溶于少量二甲基亚砜(DMSO)后加入SDB制备浓度为2.56 mg·mL-1母液，备用。调整红色毛癣菌浓度为1×105CFU/mL。参考Pereira等[13]改良CLSI M38-A2法，吸取100 μL SDB溶液加入96孔板，然后加入芳樟醇溶液连续2倍稀释至0.0625 μg·mL-1，使芳樟醇浓度为128 0～0.0625 μg·mL-1。以等量SDB溶液作为对照，最后每孔加入10 μL红色毛癣菌孢子悬液于28℃培养5 d，NCCLS方案建议将完全不生长红色毛癣菌的浓度判定为芳樟醇抑制红色毛癣菌的最小抑菌浓度。

芳樟醇对红色毛癣菌孢子萌发的影响 调整孢子悬液的浓度为1×106CFU/mL，取0.5 mL孢子悬液与0.5 mL的芳樟醇(终浓度设置为0、1/2MIC、MIC、2MIC)混匀后于28℃孵育24 h，通过显微镜观察红色毛癣菌的孢子萌发情况，以芽管长度超过孢子直径长度的一半判定为孢子萌发，计算孢子萌发率(萌发率=孢子萌发数/孢子总数×100%)[14]。

芳樟醇对红色毛癣菌菌丝径向生长及菌丝形态的影响 红色毛癣菌于SDA培养基上28℃培养14 d后，用直径12 mm的打孔器取平板中生长均匀的菌块，备用。定量配置含芳樟醇终浓度为2 MIC、MIC、1/2 MIC、1/4 MIC、1/8 MIC的SDA固体培养基，用打孔器打孔后将菌块接种至打孔处，28℃孵育7 d，并测量各组菌丝生长直径，每个处理重复3个平板。

菌丝径向生长抑制率(%)=(对照组菌落直径-实验组菌落直径)/对照组菌落直径×100%[14]。

芳樟醇浓度设置及处理同上，将不同浓度的芳樟醇与红色毛癣菌共孵育4 d后，经乳酸棉兰染色后于显微镜下观察其菌丝生长情况。

芳樟醇对红色毛癣菌细胞膜通透性的影响 调整红色毛癣菌孢子浓度为1×106CFU/mL，按1%将菌悬液接种于SDB培养基， 28℃ 120 r/min培养7 d后，菌丝体用无菌滤纸收集，水洗3次。取2 g红色毛癣菌菌丝体，加入20 mL不同浓度的芳樟醇溶液使其终浓度为2 MIC、MIC、1/2 MIC，以无菌水为对照，每组设置3组平行，于0、1、2、3、4、5 h后测定电导率[15]。

芳樟醇对细胞膜麦角甾醇合成的影响 取1 g菌丝，加入10 mL 25%氢氧化钾乙醇溶液，涡旋仪斡旋5 min后置于85℃水浴2 h。加入水∶正庚烷(1∶3)，涡旋5 min，取正庚烷层液体于-20 ℃过夜。麦角甾醇于281.5 nm下有吸收，去氢麦角固醇在230 nm下有吸收，计算麦角甾醇的含量：

麦角甾醇%+去氢麦角甾醇= [(A281.5/290)×F]/湿菌重；去氢麦角甾醇=[(A230/518)×F]/湿菌重；

麦角甾醇% =[麦角甾醇%+去氢麦角甾醇]-去氢麦角甾醇；F：稀释倍数；290和518为常数[16]。

芳樟醇对红色毛癣菌超微结构的影响 将3 mL孢子悬液与3 mL芳樟醇加入无菌试管中使终浓度为2 MIC、MIC、1/2MIC，对照添加SDB溶液，置于28℃培养7 d后以4 000 r/min离心10 min去上清液，将沉淀重悬于1.5 mL EP管中，再10 000 r/min离心15 min去上清液，沉淀加入戊二醛4℃固定4 h。固定完成后用0.1 mol/L PBS清洗3次，然后用无菌双蒸水清洗3次，再脱水、渗透、包埋聚合、切片、染色后，透射电镜观察，Gatan-780CCD拍照记录[17]。

构建红色毛癣菌感染豚鼠模型及芳樟醇药效评价 参考文献报道的方法[18]，以卡波姆为基质制备芳樟醇凝胶剂，其包含0.8 g卡波姆、5 g甘油、0.4 g丙二醇、0.032 g芳樟醇、1.08 g的三乙醇胺，加水至100 g。将40只雌雄各半的豚鼠均分为空白组、模型组、阳性对照组及芳樟醇组。在豚鼠背部进行2.5 cm×2.5 cm脱毛，粗砂纸磨伤豚鼠脱毛处皮肤并接种红色毛癣菌。除空白组外，其余组均接种红色毛癣菌，并连续4 d腹腔注射地塞米松(7.5 mg/kg)。4 d后取样皮损处皮屑，用10%的KOH处理后镜检并取皮屑接种至SDA平板判定模型是否构建成功[19]。建模成功后，阳性组施用特比萘芬凝胶，实验组施用芳樟醇凝胶，空白组和模型组则施用不含药凝胶，每日用药2次。治疗结束后，处死豚鼠，取背部皮肤用4%多聚甲醛溶液中固定48 h后，乙醇梯度脱水，二甲苯处理，石蜡包埋后进行切片，常规苏木精-伊红(HE)染色后镜检。

1.3 统计学处理

采用 GraphPad Prism 8.0软件进行统计分析。采用单因素方差分析(one-way ANOVA) ，组间采用t检验进行比较，P<0. 05认定为差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 芳樟醇抗红色毛癣菌的最小抑菌浓度

芳樟醇与红色毛癣菌于28℃共孵育5 d，结果发现阴性对照和含2.5、5、10、20、40、80、160 μg·mL-1芳樟醇溶液的孔中变浑浊，表明有红色毛癣菌的生长，但浓度为80 μg·mL-1和160 μg·mL-1的芳樟醇溶液处理后的红色毛癣菌数量明显减少，表明随着芳樟醇浓度的升高芳樟醇对于红色毛癣菌的抑制作用逐渐增强。此外，当芳樟醇药液在320 μg·mL-1浓度时，显示无红色毛癣菌生长，因此实验判定芳樟醇抑制红色毛癣菌的最小抑菌浓度为320 μg·mL-1。

2.2 芳樟醇对红色毛癣菌孢子的萌发的影响

孢子作为真菌繁殖的重要器官之一，实验发现芳樟醇呈剂量依赖性方式抑制红色毛癣菌的孢子萌发。当160 μg·mL-1的芳樟醇浓度处理后，红色毛癣菌孢子的萌发率为42.25%(P<0.0001)；芳樟醇浓度为320 μg·mL-1时，其孢子的萌发率为37.12%(P<0.0001)；而当芳樟醇浓度为640 μg·mL-1时，其萌发率仅为12.09%(P<0.0001)，表明芳樟醇能有效抑制红色毛癣菌孢子的萌发。见图1。

图1 不同浓度芳樟醇对红色毛癣菌孢子萌发率的影响 (****：P<0.0001,相比于对照) 图2 芳樟醇对红色毛癣菌菌丝的作用. A.不同浓度芳樟醇对红色毛癣菌菌丝径向生长抑制率；B.芳樟醇作用后红色毛癣菌菌丝形态变化结果(a.对照组；b.芳樟醇640 μg·mL-1；c.芳樟醇320 μg·mL-1；d.芳樟醇160 μg·mL-1；×400) 图3 芳樟醇对红色毛癣菌电导率的影响 图4 芳樟醇对红色毛癣菌麦角甾醇合成的影响(**：P<0.01,相比于对照) 图5 芳樟醇对红色毛癣菌孢子及菌丝的影响. A.未经芳樟醇处理的菌丝；B.芳樟醇处理后的菌丝；C.未经芳樟醇处理的孢子；D.经芳樟醇(160 μg·mL-1)处理后的孢子；E.芳樟醇(320 μg·mL-1)处理后的孢子；F.经芳樟醇(640 μg·mL-1)处理后的孢子Fig.1 The effect of different concentrations of linalool on the spore germination rate of Trichophyton rubrum(****：P<0.0001, Compared to control) Fig.2 The effect of linalool on the hyphae of Trichophyton rubrum A.The inhibition rate of different concentrations of linalool on the radial growth of Trichophyton rubrum hyphae; B.The morphological changes of Trichophyton rubrum hyphae after linalool (a. Control group; b. Linalool 640 μg·mL-1; c. Linalool 320 μg·mL-1; d. Linalool 160 μg·mL-1; ×400) Fig.3 The effect of linalool on the conductivity of Trichophyton rubrum Fig.4 The effect of linalool on the synthesis of ergosterol by Trichophyton rubrum (**：P<0.01, compared to control) Fig.5 The effect of linalool on the spores and hyphae of Trichophyton rubrum. A. Hypha without linalool treatment; B. Hypha after linalool treatment; C. Spores without linalool treatment; D. After linalool treatment (160 μg·mL-1); E. Spores treated with linalool (320 μg·mL-1); F. Spores treated with linalool (640 μg·mL-1)

2.3 芳樟醇对红色毛癣菌菌丝的影响

图2A显示芳樟醇对红色毛癣菌的菌丝径向生长作用，较对照组相比，40 μg·mL-1的芳樟醇浓度处理后其抑制率为10.56%。当芳樟醇浓度为320 μg·mL-1时，菌丝生长抑制率已高达88.27%。当芳樟醇浓度为 640 μg·mL-1时，几乎完全抑制菌丝的生长，结果表明芳樟醇呈剂量依赖性抑制红色毛癣菌菌丝的径向生长，随着芳樟醇浓度的升高，其菌丝的径向生长直径随之减小。此外，如图2B(a)，与对照组相比，经不同浓度芳樟醇处理后，红色毛癣菌的菌丝出现萎缩，表面变得粗糙，局部坏死，细胞质发生自溶，菌丝的多处出现断裂等现象，且随着芳樟醇浓度的增大破坏作用越明显，芳樟醇显示出对红色毛癣菌菌丝强烈的破坏作用，见图2B(b-d)。

2.4 芳樟醇对红色毛癣菌细胞膜通透性的影响

如图3所示，对照组的电导率增长缓慢，在2 h后已趋于平稳，电导率较其他组低。与对照组相比，各实验组的电导率随时间的增加而升高，且在1 h后电导率出现显著上升，说明体系中离子含量增多，可能是细胞膜被破坏，导致内容物流出。而后电导率上升幅度逐渐下降，4 h后的电导率已趋于平缓，此时体系中可能已经处于一个平衡的状态，离子不再大量渗漏，结果表明芳樟醇作用红色毛癣菌以剂量依赖性的方式引起电导率的升高，从而破坏红色毛癣菌细胞膜的通透性，导致红色毛癣菌细胞内容物泄露，细胞内离子失衡，达到抑菌效果。

2.5 芳樟醇抑制红色毛癣菌细胞膜麦角甾醇合成

实验探究了芳樟醇对红色毛癣菌与细胞膜麦角甾醇含量的影响，未经过处理的红色毛癣菌麦角甾醇含量为0.0063%，与对照组相比，160 μg · mL-1芳樟醇浓度处理后其麦角甾醇含量降低了28.6%。320 μg · mL-1芳樟醇浓度处理后，麦角甾醇含量降低了39.7%(见图4)。实验结果表明随着芳樟醇浓度的增加，红色毛癣菌细胞膜中的麦角甾醇含量减少，芳樟醇能抑制其细胞膜麦角甾醇的合成。

2.6 芳樟醇对红色毛癣菌超微结构的影响

通过透射电镜观察芳樟醇作用红色毛癣菌后的超微结构结果如图5。未经芳樟醇处理的红色毛癣菌的菌丝和孢子超微结构如图5A、C，红色毛癣菌的细胞壁完整，细胞形态结构正常，未见有细胞损伤。而经不同浓度的芳樟醇处理后的孢子如图5D、E、F，结果显示其细胞壁部分被降解，细胞的表面粗糙且厚薄不匀。此外，其细胞膜也显示皱缩破损、凹陷、轮廓模糊的现象，并伴有膜碎片的产生以及胞内物质泄露等。进一步的，细胞核也显示出轻度凝集和破碎，且随着药液作用浓度的增加，芳樟醇对红色毛癣菌超微结构的破坏作用增加。

2.7 芳樟醇治疗红色毛癣菌感染豚鼠模型的药效评价

如图6A、B所示，脱毛后豚鼠皮肤平整无伤痕，而磨皮后有渗血。图6C(c)显示豚鼠感染红色毛癣菌7 d后出现暗红色结痂，角质硬化，伴有大量皮屑产生，并取红色毛癣菌感染豚鼠背部皮屑经显微镜镜检发现红色毛癣菌菌丝，镜检结果为阳性，见图6D(d)。同时经过菌落培养显示明显的红色毛癣菌特征性菌落，见图6E(e)，表明豚鼠模型构建成功。

图6 红色毛癣菌感染豚鼠模型的建立图 图7 豚鼠皮肤表观变化 图8 豚鼠皮屑培养结果。A(a).芳樟醇用药5 d后的皮屑培养图，A为正面，a为背面；B(b).特比萘芬用药5 d后皮屑培养图，B为正面，b为背面；C(c).模型对照组未用药12 d皮屑培养图，C为正面，c为背面；D.芳樟醇用药第10天皮屑培养图；E.特比萘芬用药第12天皮屑培养图Fig.6 The establishment of the guinea pig model ofTrichophyton rubrum infection Fig.7 The apparent changes of guinea pig skin Fig.8 Results of guinea pig dander culture. A(a). Dander culture after linalool administration for 5 days, A is front, a is back; B(b). Dander culture after terbinafine administration for 5 days, B is front, b is back; C(c). Model control The dandruff culture picture of the group without medication for 12 days, C is the front, c is the back; D. The dandruff culture picture of the linalool medication on the 10th day; E. The dandruff culture picture of the terbinafine medication on the 12th day

经芳樟醇及特比萘芬凝胶给药5 d后分别见图7A(a)、C(c)，结果显示其皮屑较用药前明显减少，结痂脱落，损伤的皮肤得到恢复。另外，实验组和阳性组用药5 d后刮取皮屑经平板培养10 d后如图8A(a)和图8B(b)，结果观察到有菌落生长，菌落正面中心皱褶状颗粒隆起，并有红色色素生成，为明显的红色毛癣菌菌落特征。芳樟醇治疗10 d后如图7B(b)，皮屑消失，毛发正常生长，与阳性组处理12 d后状态无明显差别，见图7D(d)，且两组平板菌落鉴定显示无红色毛癣菌生长图8D和图8E。值得注意的是，模型组中的豚鼠感染12 d后如图7E(e)，仍存在大量的皮屑，并且伤口处皮屑堆积成块状，未脱落，将感染处皮屑接种于SDA平板生长出明显的红色毛癣菌特征菌落，见图8C(c)。此外，图7F(f)显示红色毛癣菌感染17 d后结果，皮屑持续增多并堆积成团状，且皮屑均未掉落，表明红色毛癣菌仍在侵染其皮肤。结果表明含芳樟醇的凝胶剂可治疗红色毛癣菌引起的皮肤感染，能显著控制红色毛癣菌感染豚鼠的病程，发挥出与阳性药物相当的作用，极具药物开发前景。

病理切片结果显示正常豚鼠皮肤的表皮层和真皮层之间的层次明显，且表皮层角化程度正常，皮肤棘层的厚度匀称，毛囊的数量正常并有序分布，无融合和弥散。相反，模型组中的豚鼠皮肤则出现了炎症反应及组织被破坏的现象，表现为炎细胞浸润、表皮层的角质化过度、棘层变得膨大、颗粒层的厚度增加，其毛囊也出现融合以及皮脂腺增多等现象。此外，阳性组、芳樟醇组表皮层、真皮层的结构正常，仅有轻微炎症反应，角化程度正常，棘层仅轻变增厚，颗粒层无明显变化，毛囊无弥散和融合现象，表明豚鼠皮肤损伤得到恢复。见图9。

图9 各组豚鼠皮肤病理学变化. A(a).空白组；B(b).模型组；C(c).阳性对照组；D(d).芳樟醇组(1.表皮；2.毛囊；3.颗粒层；4.棘层；5.皮脂腺；6.灶状角质化破损)Fig.9 Skin pathological changes of guinea pigs in each group. A(a). Blank group; B(b). model group; C(c). Positive control group; D(d). Linalool group (1. Epidermis; 2. Hair follicles; 3. Granular layer; 4. Spinous layer; 5. Sebaceous glands; 6. Focal keratinization damage)

3 讨 论

芳樟醇是一种挥发精油，广泛存在于植物的根茎花果中，其抗菌活性已被报道[11-12]。本研究中我们发现芳樟醇对红色毛癣菌具有较强的抑制作用，并通过改良CLSI M38-A2法测定芳樟醇抑制红色毛癣菌的MIC为320 μg·mL-1，在该浓度下，芳樟醇可显著抑制红色毛癣菌的孢子萌发(62.88%)，抑制菌丝的径向生长高达88.27%，并且呈现剂量依赖性的方式产生作用。当640 μg/mL芳樟醇浓度作用后，红色毛癣菌的孢子萌发率仅为12.09%，菌丝几乎未见径向生长。孢子作为真菌的主要繁殖器官，对于真菌菌丝的生长以及真菌的繁殖具有重要作用，菌丝聚集组成了真菌的营养体，有助于真菌获取营养生长，芳樟醇作用红色毛癣菌后可导致其菌丝萎缩、表面变粗糙、菌丝局部坏死等现象，有效遏制菌丝的生长。细胞壁和细胞膜维持着细胞的完整性和正常的生命代谢功能，我们进一步测定芳樟醇处理红色毛癣菌之后的电导率变化证实了芳樟醇可以使红色毛癣菌的细胞膜通透性发生改变，作用机制可能是芳樟醇疏水性较强，可能导致真菌细胞膜的脂质分裂，破坏细胞壁和细胞膜的完整性，导致细胞内渗透压失衡和细胞内成分泄漏，可能与同属单萜类化合物的香叶醇抗菌机制一致，其可通过破坏红色毛癣菌的细胞壁和细胞膜的方式发挥抗真菌作用[13]。另外，透射电镜也证明了芳樟醇可破坏红色毛癣菌的细胞壁以及细胞膜等。麦角甾醇是真菌细胞膜的主要组成部分，它能够维持细胞膜的流动性并且是细胞膜的结构骨架[20]。研究证明芳樟醇可以抑制红色毛癣菌细胞膜成分麦角甾醇的合成，使细胞膜稳定性下降，细胞膜完整性受损。先前的研究发现特比萘芬可抑制角鲨烯环氧化酶的活性，使鲨烯不能环氧化，导致鲨烯大量积累，使麦角甾醇合成减少，从而抑制真菌生长[21]，后续可进一步探究芳樟醇作用后角鲨烯环氧化酶的活性变化，明确芳樟醇引起的细胞膜成分的改变及合成酶的活性变化等。此外，皮肤癣菌的致病机制较为复杂，且易传染，因此在后续的研究中可进一步研究芳樟醇抗红色毛癣菌作用机制，如芳樟醇能否影响红色毛癣菌细胞壁的合成与组装，影响膜电位、线粒体的活性以及活性氧自由基的生成，对于深入了解芳樟醇抗红色毛癣菌的机理以及抗真菌药物的开发有重要意义。

豚鼠常用于皮肤感染模型的建立，在本研究中，我们成功构建了红色毛癣菌感染的豚鼠模型，并以卡波姆为基质制备了一种含芳樟醇的凝胶制剂。将其用于动物感染的皮肤癣病的治疗，实验结果发现给药后能显著控制红色毛癣菌的感染状况，改善皮肤损伤，显示出与阳性药物特比萘芬凝胶相同的效果，证明芳樟醇对红色毛癣菌的感染具有治疗作用。另外，在更进一步的研究中还可针对药物载药的剂型进行研究，为临床治疗皮肤癣菌病奠定基础。综上，芳樟醇可能是控制皮肤癣病的一种潜在杀真菌剂，有助于将芳樟醇作为新型外用皮肤病药物进行开发。