毛霉病现状分析及PCR技术在其诊断中的应用

阎香言 王志贤 张傲 白雪秋

[天津市侵袭性真菌病精准诊断技术企业重点实验室 丹娜(天津)生物科技股份有限公司，天津 300467]

1 毛霉病的现状分析

1.1 毛霉病介绍

毛霉曾归属于接合菌亚门，毛霉目真菌引起的毛霉病(mucormycosis)以及虫霉目真菌引起的虫霉病(entomophthoramycosis)合称为接合菌病[1]。Hibbett等[2-3]基于基因序列分析研究对真菌界进行了重新分类，接合菌纲包括多种真菌类别，毛霉和虫霉是进化距离远、各自独立的两类真菌。毛霉和虫霉均被独立划分为毛霉亚门和虫霉亚门，由毛霉引起的疾病也被称为毛霉病[3]。毛霉目下毛霉科中的根霉属、毛霉属、根毛霉属及横梗霉属以及毛霉目下小克银汉霉科中的小克银汉霉属等较为常见[4]。

近些年，随着广谱抗生素、皮质类固醇激素、抗肿瘤药物及免疫抑制剂的普遍应用和糖尿病、艾滋病患者的增多，实体器官及骨髓移植、烧伤抢救和其他延长生命技术的广泛使用，都为条件致病真菌的繁殖和致病提供了良好的条件，该病的发病率有明显增加趋势[1]。毛霉病的五种主要感染部位中以肺部最为常见，肺毛霉病的特征性病理改变为浸润、血栓形成和坏死。最易侵犯肺上叶，死亡率高达56%，近期临床观察呈慢性经过的肺毛霉病[5]，主要见于糖尿病患者，及时确诊并积极控制血糖及抗真菌治疗可显著提高患者生存率[1]。由于毛霉病具有进展迅速、易误诊漏诊、病死率高等特点，其早期诊断与治疗一直是困扰临床的一大难题，因此发展有效的毛霉病检测方法对该病的早期诊断与治疗尤为重要。

1.2 毛霉病流行病学

发病率逐年升高 毛霉病是一种进展迅速的侵袭性真菌病，近年来发病率不断增加，在人群中每年可达到1.2/100万人。在真菌感染中，毛霉病发病率占8.3%～13%，仅次于念珠菌和曲霉感染，居于第3位；2005—2014年，美国毛霉病的发病率每年增长7%，死亡率每年增长9.3%；2010—2014年，印度毛霉病的发病率每年增长0.014%；2000—2010年，法国毛霉病的发病率每年增长7%；2008—2014年，伊朗毛霉病的发病率为9.7%～23.7%[6-7]，在新冠疫情之前，毛霉病已经是印度的一大问题，印度毛霉病的发病率是发达国家平均水平的80倍，高达14/10万人，随着新冠疫情的爆发，合并毛霉感染的病例急剧增加，毛霉病已经成为印度“流行病中的流行病”。在国外，毛霉病发病率呈现逐年上升的趋势[8-9]；同样，近年来，我国关于毛霉病的发病率也呈逐年上升的趋势。王思卜等[10]对接合菌病流行现状进行回顾性分析，中国大陆地区接合菌病感染率有上升趋势，其中感染类型以毛霉病为主。Lin等[11]对中国大陆毛霉病病例进行系统回顾，包括390例病例。大多数患者为男性(61.3%)，糖尿病是最常见的易感因素(37.2%)。肺毛霉病(42.1%)最常见，其次是皮肤感染(21.0%)。

发病地域性差异 根霉属在各个地域均发病率最高，横梗霉属感染在欧洲更为频繁(法国29%，西班牙42%)；鳞质霉属感染主要在热带或温暖气候地区，澳洲鳞质霉属感染仅次于根霉属[6]，此次在印度爆发的新冠疫情，合并毛霉感染的主要是鳞质霉属；非洲横梗霉属感染仅次于根霉属；亚洲毛霉属、横梗霉属及鳞质霉属感染率相差不大，次于根霉属；美国毛霉属感染较高，仅次于根霉属，鳞质霉属也有多发。

不同种属发病率差异 在447/851例毛霉病病例中鉴定出8属28种，其中根霉属(48%)最常见，其次是毛霉属(14%)、横梗霉属(13%)、小克银汉霉属(7%)和根毛霉属(6%)[6]。免疫缺陷患者多由呼吸道吸入感染，粒细胞缺乏症患者多表现为肺部毛霉病，糖尿病患者表现为鼻脑毛霉病；免疫功能正常患者中胃肠道毛霉病最常见，死亡率高[6-7]。小克银汉霉属在患有肺部或播散性疾病患者中更为常见；而根霉在鼻-眼眶-脑毛霉病患者中更为常见；横梗霉属感染在皮肤组织毛霉病患者中更为常见[6]。最近，印度新冠肺炎患者中合并毛霉感染的病例急剧增加，其中鳞质霉属最常见。

死亡率高LancetInfectionDisease于2019年发布的《毛霉病诊疗全球指南》中提到，毛霉病的全死亡率40%～80%[12]，取决于宿主基础状况、感染菌种和感染部位。小克银汉霉属感染患者的死亡率(77%)常高于横梗霉属(35%)、根霉属(39%)、毛霉属(41%)和根毛霉属(47%)[6-7]。血液系统恶性肿瘤、HSCT(造血干细胞移植)、重度烧伤患者预后非常差。如果发生播散感染尤其累及CNS(中枢神经系统)，病死率高达80%。肺毛霉病最易侵犯肺上叶，死亡率高达56%。20世纪中叶以来，糖尿病、恶性肿瘤、SOT(实体器官移植)及HSCT(造血干细胞移植)成为毛霉病的主要危险因素。毛霉病病死率高，预后差，应引起临床重视。早发现、早诊断、早治疗尤为重要，寻找快速诊断的技术显得非常必要。

1.3 毛霉病的传统诊断方法

目前用于毛霉病诊断的方法有真菌直接镜检、真菌培养、组织病理、血清学检测等。

直接镜检 能够快速地对毛霉病做出疑似诊断。镜下特征表现为宽窄不一、无隔或少隔、呈直角分枝、不规则的丝带状菌丝体。由于毛霉是实验室或皮肤黏膜表面常见污染菌，因此直接刮取鳞屑获得的镜检结果不能作为组织浸润的可靠证据，直接镜检不能对感染菌株进行种属鉴定[13]。

真菌培养 菌种鉴定的关键就是真菌培养。可以对分离出来的菌株进行菌种鉴定和体外药敏试验。毛霉在大多数培养基中均可迅速生长，培养温度通常为37℃。需要注意的是培养前应避免样本的过度研磨，否则易出现假阴性结果[13]。

组织病理 毛霉病的组织病理学特点包括明显的梗死、血管浸润和外周神经浸润等[9]。肺毛霉病的组织病理学特点包括血管受累(100%)、出血性梗死(90%)、凝固性坏死(85%)、肺泡内出血(85%)[13]。

血清学检测 目前还没有标准化的方法检测毛霉特异性抗原。G试验是针对真菌细胞壁1，3-β-D葡聚糖的抗原检测，但毛霉亚门的细胞壁少有1，3-β-D葡聚糖的表达[6]；同时半乳甘露聚糖抗原(galactomannoglycan，GM)试验是烟曲霉较为特异的血清学检测方法，因此G试验和GM试验均不适用于毛霉病的诊断。当CT检查高度提示侵袭性真菌病，而血清及肺泡灌洗液中GM试验结果阴性时，应高度警惕可能是毛霉病。GM试验在毛霉病诊断中仅可作为排他性方法而非特异性诊断方法[13]。

2 PCR技术在毛霉病诊断中的研究及应用

应用于毛霉病诊断中的PCR技术为实时荧光定量PCR技术，即在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线的分析对起始模板进行定量分析。PCR技术是近年来发展迅速的临床检测分析技术。采用PCR技术进行毛霉病检测较常规方法更快速、具有更高的灵敏度和特异性，重复性好，该方法检测毛霉病为临床诊断和治疗提供了重要依据。

2.1 高分辨率熔解曲线方法的应用

高分辨率熔解曲线方法(PCR/HRM)适合检测支气管肺泡灌洗液(BALF)样本中的根霉属、根毛霉属、横梗霉属和毛霉属。2010年，Hrncirova等[14]收集31株真菌，包括10株毛霉和21株其他丝状真菌。采用Bialek等[15]推荐的方法，针对毛霉属序列中的18S核糖体DNA (rDNA)设计特异性引物探针，进行实时荧光定量PCR，用高分辨率熔解曲线方法(PCR/HRM)进行物种区分，所有毛霉分离株均得到正确鉴定。同时Hrncirova等[14]对12例组织样本进行回顾性分析，结果发现，从经过组织病理学或培养证实的7个毛霉病患者中，PCR均呈阳性，且在所有病例中，均能直接检测毛霉菌种：根霉(n=4)、伞枝犁头霉(n=2)和根毛霉(n=1)；来自无真菌病患者5个的组织标本(来自无真菌病患者)均为阴性。应用高分辨率熔解曲线方法(PCR/HRM)进行物种区分，可直接检测毛霉菌种。使用高分辨率熔解曲线方法(PCR/HRM)非常简单，能够快速准确地检测和鉴定组织样本和培养分离物中的毛霉。它能区分临床主要毛霉，且与非毛霉菌丝状真菌无交叉反应。该方法具有较高的敏感性和特异性，适用于临床常规诊断。

2014年，Lengerova等[16]对99份支气管肺泡灌洗液(BALF)样本进行回顾性分析，在ITS2区域设计特异性引物探针，使用高分辨率熔解曲线方法(PCR/HRM)检测，其中90份(91%)的BALF样本为阴性，而9份(9%)的样本为阳性，敏感性和特异性分别为100%和93%。同时将高分辨率熔解曲线方法(PCR/HRM)的阳性结果与种间特异实时荧光定量PCR的阳性结果相结合，特异性提高到98%。

2.2 半巢式PCR和测序方法的应用

对于各种类型的样本，PCR技术均有较高的特异性和敏感性。2011年，Hammond等[17]对29例FFPE(福尔马林固定石蜡包埋的组织样品)进行回顾性分析，针对毛霉属序列中的18S核糖体DNA (rDNA)进行半巢式PCR和测序，在12例培养阳性的毛霉感染的病例中，有10例PCR阳性(83%)，9例测序结果与培养结果在属水平一致；在16例培养阴性病例中，PCR检测12例为阳性，根霉属(n=4)、小克银汉霉属(n=4)、根毛霉属(n=3)和横梗霉属(n=1)，测序结果与PCR结果在属水平一致。由此可见，PCR法应用于临床对于毛霉病的准确诊断具有重要意义。

对于毛霉而言，检测靶点非常丰富，其中18S rDNA、ITS2区域、28s rDNA以及CotH基因等均能成功检测。2019年，Millon等[6]使用3种方法检测毛霉，第1种是在ITS区设计泛真菌引物，进行测序检测；第2种是在毛霉的18s rDNA区设计毛霉菌目特异性引物，进行半巢式PCR检测；第3种是在28s rDNA区设计毛霉菌目特异性引物，进行实时荧光定量PCR检测。检测的样本类型有：新鲜/冷冻组织、福尔马林固定的石蜡包埋(FFPE)样本、支气管肺泡灌洗液(BALF)、尿液。结果表明：这3种方法都可以检测，使用实时荧光定量PCR技术检测，新鲜/冷冻样本比福尔马林固定的石蜡包埋(FFPE)样本效果更好。

2.3 多重实时荧光定量PCR方法的应用

2013年，Bernal Martínez等[18]应用多重实时荧光定量PCR(MRT-PCR)检测22株培养菌株及12例毛霉病患者的临床样本。结果显示，对临床培养的菌株和临床样本的特异性为100%，敏感性为100%[19]。该研究证实，从培养物到临床样本，多重实时荧光定量PCR(MRT-PCR)均表现出良好的特异性和敏感性，该技术可用于临床诊断和进一步的研究是必要的。

2.4 实时荧光定量PCR方法的应用

2016年，Springer等[20]对15份组织样本进行回顾性分析，包括有典型毛霉病组织学特征的组织样本(n=11)和4个对照样本(无侵袭性真菌病的典型症状或特征)。在18S区域设计特异性引物探针，使用实时荧光定量PCR检测。在11例毛霉病样本中检测到10例阳性，敏感性为91%，特异性100%。PCR方法更快速、更特异，可以快速区别毛霉和曲霉感染，有助于早期诊断，早期治疗，对制定抗真菌方案及患者预后有重要作用。

2018年，Scherer等[21]对337例患者的405份支气管肺泡灌洗液(BALF)样本进行回顾性分析，在337例患者中，使用实时荧光定量PCR法检测BALF样本，阳性15例，阴性322例。在15例阳性患者中，确诊或疑似的毛霉病5例，疑似的侵袭性曲霉病3例，可能的侵袭性真菌病6例，无侵袭性真菌病1例。在本组中，使用实时荧光定量PCR法诊断疑似或确诊肺毛霉病的敏感性和特异性分别为100%和97%。在9例疑似和确诊的毛霉病患者中，有6例检测BALF样本阳性，同时检测血清样本也为阳性，并与所鉴定的物种一致[20]。这一发现进一步提高了实时荧光定量PCR结果的价值，血清和BALF样本的阳性结果结合更促进临床医生完成早期诊断，启动精准治疗。

欧洲临床微生物学和传染病学会(ESCMID)真菌感染研究组(EFISG)和欧洲医学真菌学联合会(ECMM)联合临床指南中强调，无论采用何种PCR技术(泛真菌引物的实时荧光定量PCR或毛霉特异性引物的实时荧光定量PCR)，对福尔马林固定的石蜡包埋(FFPE)样本进行检测时，分析灵敏度为56%～80%，对新鲜组织样本进行检测时，灵敏度为97%～100%[6]。近年来Clara等认为编码CotH基因的孢子包衣蛋白同源物是毛霉中唯一且普遍存在的。因此，CotH基因是毛霉病快速诊断的潜在靶点。Clara等使用不同的毛霉感染小鼠，并验证实时荧光定量PCR方法可否检测到CotH基因；同时用未感染毛霉病小鼠和感染曲霉小鼠验证该方法的特异性。在感染后24 h血浆、尿液和支气管肺泡灌洗液(BALF)样本中检测到了CotH基因，这些样本均来自于感染了根霉、米根霉、毛霉、伞枝犁头霉或小克银汉霉的小鼠，而不是从未感染的小鼠或感染了烟曲霉的小鼠身上采集的样本。检测尿液样本中CotH基因比血浆或BALF样本更可靠，检测灵敏度为90%，特异性为100%[22]。

目前已有成品试剂盒可用于检测毛霉，比如丹娜(天津)生物科技股份有限公司的MycoMDx Mucor PCR Assay试剂盒以及荷兰PathoNostics的MucorGenius©PCR等。2020年，Guegan等[23]对319例肺组织样本进行回顾性分析，同时采用直接检查、真菌学培养和毛霉特异性引物PCR检测以及MucorGenius©PCR等方法检测侵袭性霉菌病感染情况，同时还收集了半乳甘露聚糖(GM)的检测结果，显示毛霉特异性引物PCR和MucorGenius©PCR检测阳性结果分别为33例(10.3%)和27例(8.5%)，而培养阳性结果仅10例(3.1%)。毛霉特异性引物PCR和MucorGenius©PCR检测灵敏度分别为100%(10/10)和90% (9/10)，特异性分别为95.7%和97.9%。两种PCR检测方法都可以检测出10个可能病例和6个IA样本中的毛霉DNA，但培养均未检测到。与显微镜检查和培养的传统真菌学相比，毛霉特异性引物PCR和MucorGenius©PCR检测显著提高了毛霉的检出率。两种PCR检测方法使阳性样本的数量增加了近3倍。两种PCR检测方法对已证实和可能病例的敏感性高，分别达到100%(10/10)和90%(9/10)[23]，PCR技术的应用可以提高毛霉病的实验室诊断水平。

毛霉病的发病率呈逐年上升，组织病理是毛霉病确诊的金标准，但属于侵入性检查且耗时长、给患者带来不适等。除了皮肤型毛霉病，临床样本尤其血液样本的培养阳性率较低。在929例毛霉病的系统回顾研究中，培养阳性率仅为50%[9]。和侵袭性曲霉病、念珠菌病、隐球菌病不同，目前还没有像GM试验、G试验、多糖荚膜抗原这样的较为敏感的血清学抗原检测技术用于毛霉病的快速诊断，毛霉病的早期快速诊断鉴定尤其步履维艰。

综上所述，PCR技术在毛霉病的快速诊断中显示出了良好的潜力。PCR技术适用于检测多种样本，包括但不限于真菌菌体、新鲜/冷冻组织、FFPE(福尔马林固定石蜡包埋的组织样品)、BALF(支气管肺泡灌洗液)、血液、尿液等，且检测靶点丰富，其中18S rDNA、ITS2区域、28s rDNA以及CotH基因等均能成功检测，此外还可应用高分辨率熔解曲线方法(PCR/HRM)进行物种区分，可直接鉴定毛霉菌种。

3 小结与展望

毛霉病是除了常见的曲霉病和念珠菌病之外，位列第三的侵袭性真菌感染疾病[24]。近年来，随着临床上免疫系统受损患者的日渐增加，毛霉病发病率逐年升高。同时，毛霉病的传统诊断方法伴随有耗时长、易污染、敏感性低和假阳率高等特点。鉴于此，毛霉病的诊断迫切需要一种敏感、特异、快速的检测技术以应用于早期诊断，早期治疗。PCR技术是一项成熟可靠的技术，基于此的多重实时荧光定量PCR方法也经历了长时间的技术发展和进步，现在已经处于成熟稳定的阶段，市面上已经有大量应用该技术的成熟产品上市。快速、敏感、精确的PCR技术是该类病原菌检验的发展大趋势，结合现有的影像学检查及组织病理，建立新型真菌联合检测方案，形成新型真菌诊断方案，为临床医生对毛霉病患者的诊疗提供快速而科学的依据。