水飞蓟素对快速型黄羽肉鸡抗氧化能力、免疫功能及肠道菌群的影响

周昭彬 王维维 徐钰栋 赖宇谦 白心亮 宋泽和 刘自逵* 贺 喜*

(1.湖南农业大学动物医学院，长沙410125；2.内蒙古昶辉生物科技股份有限公司，通辽028400；3.湖南农业大学动物科学技术学院，长沙410128)

目前，我国禁止在畜禽饲料中添加抗生素，因此各种植物添加剂的开发愈加重要。水飞蓟素是从水飞蓟干燥成熟果实中提取得到的黄酮类天然化合物，其主要成分是水飞蓟宾、异水飞蓟宾、水飞蓟亭和水飞蓟宁[1]。药理学研究发现，水飞蓟素具有抗氧化[2]、增强免疫功能[3-4]、调节脂质代谢[5]等作用。近年来，水飞蓟素在养殖业上的用途愈加广泛，如饲粮中添加水飞蓟素胶束可以通过提高母猪血清中催乳素浓度以提高母猪产奶量，从而提升断奶仔猪的窝重、仔猪个体重量和平均日增重[6]。肉鸡饲粮中添加250 mg/kg的水飞蓟素可调节流感病毒抗体滴度和绵羊红细胞(SRBC)抗体滴度[7]。黄羽肉鸡是我国优质肉鸡品类，但目前缺少水飞蓟素对黄羽肉鸡的作用探索，因此，本试验旨在研究饲粮中添加不同剂量水飞蓟素对黄羽肉鸡抗氧化能力、免疫功能及肠道菌群的影响，从而为水飞蓟素作为黄羽肉鸡饲料添加剂提供理论参考和技术支持。

1 材料与方法

1.1 试验材料

水飞蓟素由内蒙古某生物科技股份有限公司提供，有效含量≥80%。

1.2 试验动物与设计

试验选取288羽1日龄体质健康的快速型黄羽肉鸡，随机分成4组，每组6个重复，每个重复12羽。对照组(CON组)饲喂基础饲粮，低剂量组(S250组)、中剂量组(S500组)、高剂量组(S750组)在基础饲粮的基础上分别添加250、500、750 mg/kg水飞蓟素。试验期56 d，1～28日龄为试验前期，29～56日龄为试验后期。

1.3 试验饲粮

基础饲粮以玉米、豆粕为主要原料，参照《鸡饲养标准》(NY/T 33—2004)进行配制，其组成及营养水平见表1。

表1 基础饲粮组成及营养水平(风干基础)

续表1项目Items含量 Content1～28日龄1 to 28 days of age29～56日龄29 to 56 days of age蛋氨酸 Met0.470.41蛋氨酸+半胱氨酸 Met+Cys0.800.71钙 Ca1.000.90总磷 TP0.680.64有效磷 AP0.400.36粗纤维 CF2.912.75

1.4 饲养管理

试验鸡采用3层笼养。试验前对鸡舍进行充分冲洗和严格消毒，入雏前24 h将鸡舍升温至32～35 ℃，此后温度每周降低2～3 ℃，直至保持在22～24 ℃为止。试验期舍内光照、湿度和温度根据常规饲养管理要求进行控制，鸡只按正常免疫程序进行免疫。整个试验期鸡自由采食和饮水。

1.5 样品采集

于试验29和57日龄(空腹8 h)，每个重复选体重相近的1只肉鸡进行屠宰取样。采集适量肝脏、空肠黏膜和盲肠食糜，液氮中速冻后，于-80 ℃冰箱中保存待测。

1.6 测定指标

1.6.1 肝脏抗氧化指标测定

使用南京建成生物工程研究所试剂盒进行肝脏总抗氧化能力(T-AOC)及超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性的测定。

1.6.2 空肠黏膜分泌型免疫球蛋白(SIgA)含量测定

使用江苏雨桐生物科技有限公司酶联免疫吸附检测试剂盒(CK-E60068)测定空肠黏膜SIgA含量。

1.6.3 实时荧光定量PCR(RT-qPCR)测定

将部分肝脏组织与空肠黏膜RNA裂解液匀浆后，按照SteadyPure通用型RNA提取试剂盒(AG21022，购自湖南艾科瑞生物工程有限公司)说明书操作进行肝脏RNA提取。得到RNA后，按照Evo M-MLV反转录试剂盒(AG11706，购自湖南艾科瑞生物工程有限公司)说明书操作进行，反转录得到cDNA，采用SYBR Green(AG11701，购自湖南艾科瑞生物工程有限公司)嵌合荧光法进行RT-qPCR检测，引物序列见表2。目的基因包括核因子E2相关因子2(Nrf2)、谷氨酸半胱氨酸连接酶催化亚基(GCLC)、NAD(P)H醌氧化还原酶1(NQO1)、干扰素-γ(IFN-γ)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6)、免疫球蛋白G(IgG)和免疫球蛋白M(IgM)。以β-肌动蛋白(β-actin)作为内参基因，根据2-ΔΔCt法对定量结果进行计算分析。

1.6.4 盲肠肠道菌群

采用16S的测序方法测定盲肠微生物的组成及结构(上海派森诺生物科技有限公司)。

1.7 数据统计分析

数据经Excel 2007整理后，采用SPSS 22.0软件进行单因素方差分析和Duncan氏法多重比较，结果以平均值和均值标准误(SEM)表示，以P<0.05为显著性水平。

2 结 果

2.1 水飞蓟素对黄羽肉鸡肝脏抗氧化指标的影响

如表3所示，与CON组相比，S250组、S500组、S750组肉鸡前期和后期肝脏T-AOC显著升高(P<0.05)；S250组、S500组、S750组肉鸡前期肝脏SOD活性显著升高(P<0.05)，S750组肉鸡后期肝脏SOD活性显著升高(P<0.05)；S500组、S750组肉鸡前期肝脏CAT活性显著升高(P<0.05)，S250组肉鸡后期肝脏CAT活性显著升高(P<0.05)；S250组、S500组肉鸡前期和后期肝脏GSH-Px活性显著升高(P<0.05)。

表2 RT-qPCR引物序列

表3 水飞蓟素对黄羽肉鸡肝脏抗氧化指标的影响

续表3项目Items组别 GroupsCONS250S500S750SEMP值 P-value处理Treatment线性Linear二次Quadratic过氧化氢酶CAT21.51±1.83b31.12±2.15a22.97±1.47b20.64±1.81b1.150<0.0010.022<0.001谷胱甘肽过氧化物酶GSH-Px211.21±1.94c412.23±27.40a321.78±18.04b220.45±23.12c21.679<0.0010.188<0.001

2.2 水飞蓟素对黄羽肉鸡肝脏Nrf2、GCLC和NQO1 mRNA表达量的影响

如表4所示，与CON组相比，S250组、S500组、S750组肉鸡前期和后期肝脏GCLCmRNA表达量显著升高(P<0.05)；S250组、S500组、S750组肉鸡前期肝脏Nrf2 mRNA表达量显著升高(P<0.05)，S500组、S750组肉鸡后期肝脏Nrf2 mRNA表达量显著降低(P<0.05)；S750组肉鸡前期肝脏NQO1 mRNA表达量显著升高(P<0.05)，S500组、S750组肉鸡后期肝脏NQO1 mRNA表达量显著升高(P<0.05)。

表4 水飞蓟素对黄羽肉鸡肝脏Nrf2、GCLC和NQO1 mRNA表达量的影响

2.3 水飞蓟素对黄羽肉鸡空肠黏膜免疫相关基因mRNA表达量的影响

如表5所示，与CON组相比，S500组、S750组肉鸡前期空肠黏膜IFN-γmRNA表达量显著升高(P<0.05)，S250组、S500组肉鸡后期空肠黏膜IFN-γmRNA表达量显著升高(P<0.05)；S500组肉鸡前期空肠黏膜TNF-αmRNA表达量显著升高(P<0.05)，S250组、S500组肉鸡后期空肠黏膜TNF-αmRNA表达量显著升高(P<0.05)；S250组、S500组、S750组肉鸡前期和后期空肠黏膜IL-6 mRNA表达量显著升高(P<0.05)；S250组、S500组、S750组肉鸡前期空肠黏膜IgGmRNA表达量显著降低(P<0.05)，S250组、S500组、S750组肉鸡后期空肠黏膜IgGmRNA表达量显著升高(P<0.05)；S500组、S750组肉鸡前期空肠黏膜IgMmRNA表达量显著升高(P<0.05)，S250组、S500组、S750组肉鸡后期空肠黏膜IgMmRNA表达量显著降低(P<0.05)。

表5 水飞蓟素对黄羽肉鸡空肠黏膜免疫相关基因mRNA表达量的影响

2.4 水飞蓟素对黄羽肉鸡空肠黏膜SIgA含量的影响

如表6所示，与CON组相比，S500组肉鸡后期空肠黏膜SIgA含量显著升高(P<0.05)。

表6 水飞蓟素对黄羽肉鸡空肠黏膜SIgA含量的影响

2.5 水飞蓟素对黄羽肉鸡肠道菌群的影响

如图1所示，与CON组相比，S250组、S500组、S750组肉鸡前期盲肠菌群Chao1、Goods_coverage、Shannon、Simpson和Observed_species指数均显著升高(P<0.05)。

*表示与对照组相比差异显著(P<0.05)。

如表7所示，各组肉鸡前期和后期盲肠优势菌群均为厚壁菌门(Firmicutes)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、变形菌门(Proteobacteria)和软壁菌门(Tenericutes)。与CON组相比，S250组、S500组、S750组肉鸡前期盲肠Firmicutes门相对丰度均显著升高(P<0.05)，盲肠Bacteroidetes门相对丰度显著降低(P<0.05)；S750组肉鸡后期盲肠Tenericutes门相对丰度显著降低(P<0.05)。

如表8所示，与CON组相比，S250组、S500组、S750组肉鸡前期盲肠粪杆菌属(Faecalibacterium)相对丰度显著升高(P<0.05)，盲肠另枝菌属(Alistipes)、AF12相对丰度显著降低(P<0.05)；S500组肉鸡后期盲肠布劳特氏菌属(Blautia)相对丰度显著升高(P<0.05)。

表7 盲肠菌群在门水平上的物种组成

表8 盲肠菌群在属水平上的物种组成

续表8项目Items组别 GroupsCONS250S500S750SEMP值 P-value处理Treatment线性Linear二次QuadraticBatyricicoccus0.868±1.1880.986±0.6190.179±0.0300.404±0.1350.1460.1590.0890.84929～56日龄 29 to 56 days of ageFaecalibacterium14.032±14.84310.560±7.25918.995±11.40517.754±13.7632.4170.6280.3880.825Oscillospira7.042±2.7269.642±2.8678.860±3.77411.083±9.1731.0610.6250.2580.932Alistipes6.760±8.9177.873±7.0486.475±7.5416.365±10.1231.6210.9890.8690.862Ruminococcaceae_Ruminococcus3.578±1.8064.547±2.6894.566±2.7714.306±1.2910.4320.8540.5940.507AF124.661±3.7695.032±1.8942.757±1.4153.508±1.8820.4970.3620.2080.849Lactobacillus1.980±1.6062.614±3.6531.461±1.2173.147±3.5630.5390.7330.6440.643Ruminococcus2.478±1.0302.611±1.6472.207±1.0091.606±0.9630.2410.4910.1820.461Blautia1.780±0.401b1.118±0.396b3.526±2.111a1.468±0.826b0.2950.0090.4980.159Subdoligranulum1.979±2.3911.116±1.0180.802±0.4622.185±1.6350.3190.3700.9160.092Streptococcus1.678±2.3322.340±3.7430.320±0.4591.243±2.1270.4920.5560.4670.898

如图2所示，试验前期，CON组肉鸡盲肠的优势菌属为另枝菌属(Alistipes)、HB2_32_21、AF12和科尔韦尔氏菌属(Colwellia)，S250组肉鸡盲肠的优势菌属为粪杆菌属(Faecalibacterium)和颤螺菌属(Oscillospira)，S500组肉鸡盲肠的优势菌属为乳杆菌属(Lactobacillus)，S750组肉鸡盲肠没有出现优势菌属。试验后期，CON组、S750组肉鸡盲肠没有出现优势菌属，S250组肉鸡盲肠的优势菌属为双歧杆菌属(Bifidobacterium)，S500组肉鸡盲肠的优势菌属为Anaerofustis。

以线性判别分析评分>2为差异筛选阈值。

3 讨 论

3.1 水飞蓟素对黄羽肉鸡肝脏抗氧化能力及Nrf2、GCLC和NQO1 mRNA表达量的影响

T-AOC反映动物机体抗氧化能力；SOD、CAT、GSH-Px是机体主要的抗氧化酶，能够清除过多的自由基[8]，其活性的高低可以评定动物体抗氧化功能。Yu等[9]研究发现，水飞蓟素可提高赭曲霉毒素诱导的鸡原代肝细胞的SOD活性；Oskoueian等[10]研究发现，水飞蓟素可提高热应激鸡肝细胞中SOD和CAT活性。本试验中，水飞蓟素可以提高黄羽肉鸡肝脏T-AOC，改善SOD、CAT、GSH-Px活性，与Yu等[9]、Oskoueian等[10]研究结果一致。此外，本试验结果还显示，在黄羽肉鸡生长前期，随着水飞蓟素添加量的增加，黄羽肉鸡肝脏抗氧化能力增强；在黄羽肉鸡生长后期，随着水飞蓟素添加量的增加，水飞蓟素增强黄羽肉鸡肝脏抗氧化能力的效果减弱。

Nrf2是调控机体抗氧化能力的重要转录因子，能介导下游基因GCLC、NQO1的转录[11]，具有调节SOD、CAT等抗氧化酶表达的作用[12]。胡俊等[13]研究发现，水飞蓟素能提高HepG2细胞Nrf2 mRNA表达量；李亮[14]研究发现，水飞蓟素可以提高PC12细胞Nrf2、GCLCmRNA表达量，且与剂量呈正相关。本试验结果显示，水飞蓟素可以提高肝脏GCLC、NQO1 mRNA表达量，与前人研究结果一致。且本试验中，在黄羽肉鸡生长前期，肝脏GCLC、NQO1 mRNA表达量与水飞蓟素添加量呈正相关；在黄羽肉鸡生长后期，随着水飞蓟素添加量的增加，水飞蓟素增强黄羽肉鸡肝脏GCLC、NQO1 mRNA表达量的效果逐渐减弱。水飞蓟素对肝脏GCLC、NQO1 mRNA表达量的影响与对肝脏SOD、CAT、GSH-Px活性的作用一致，表明水飞蓟素通过上调黄羽肉鸡肝脏GCLC、NQO1 mRNA的表达量以改善SOD、CAT、GSH-Px活性，进而发挥抗氧化作用。

3.2 水飞蓟素对黄羽肉鸡免疫功能的影响

细胞因子IFN-γ和TNF-α具有免疫调节活性[15-16]。IFN-γ、TNF-α由Th1细胞分泌，可诱导T、B淋巴细胞分化增殖，从而介导细胞免疫应答[16-17]。本试验中，饲粮中添加中剂量水飞蓟素提高了肉鸡前期空肠黏膜中IFN-γ、TNF-αmRNA表达量，添加低、中剂量水飞蓟素提高了肉鸡后期空肠黏膜中IFN-γ、TNF-αmRNA表达量，与Rodríguez-Flores等[18]研究结果相似。IL-6由Th17细胞产生[17]，Th17细胞参与促炎反应，调节性T细胞(Treg)能减轻炎症，Treg/Th17细胞的平衡状态对于机体免疫功能具有重要影响[19]。本试验中，饲粮中添加3种不同剂量的水飞蓟素均提高了肉鸡空肠黏膜IL-6 mRNA表达量，可能是因为水飞蓟素促进了初始T细胞分化为Treg[4]，为维持机体Treg/Th17细胞平衡，水飞蓟素增加Th17细胞数量从而使得空肠黏膜中IL-6含量升高。免疫球蛋白是B淋巴细胞受抗原刺激之后合成并分泌于体液中能够与抗原产生特异性反应的球蛋白[20]。张洪[21]通过水飞蓟素治疗淋巴瘤，发现治疗后患者血清IgG和IgM含量升高。本试验中，饲粮中添加中、高剂量水飞蓟素能上调肉鸡前期空肠黏膜IgMmRNA表达量，添加低、中、高剂量水飞蓟素均能上调肉鸡后期空肠黏膜IgGmRNA表达量，与前人研究结果一致。因此，水飞蓟素或是在一定程度上刺激肉鸡空肠B淋巴细胞增殖，从而提高IgG、IgMmRNA表达量。此外，在试验前期添加水飞蓟素使肉鸡空肠黏膜IgGmRNA表达量下降，试验后期添加水飞蓟素使IgMmRNA表达量下降，可能是因为肉鸡空肠黏膜中已经积聚大量的IgG或IgM，肉鸡空肠黏膜中的IgG或IgM已经能够满足机体的需要。

SIgA是由呼吸道和消化道黏膜固有层B淋巴细胞分泌的一种抗体[22]，其是黏膜免疫的主要效应因子。本试验中，饲粮中添加中剂量水飞蓟素提高了肉鸡后期空肠黏膜SIgA含量。郭秀丽等[23]也得出了类似的结论，其通过给大鼠饲喂高脂饮食并添加水飞蓟素，发现水飞蓟素能提升高脂饮食大鼠小肠SIgA含量。有研究表明，水飞蓟素能促进脂多糖(LPS)诱导的B淋巴细胞增殖[24]。因此，水飞蓟素或是通过促进肉鸡B淋巴细胞增殖继而促进空肠黏膜SIgA含量的升高。

综上所述，水飞蓟素对黄羽肉鸡空肠黏膜免疫功能具有一定的调节作用。

3.3 水飞蓟素对黄羽肉鸡盲肠菌群的影响

本研究对肉鸡盲肠菌群进行了16S rRNA测序。α多样性分析用于研究特定环境内或单一样本中的多样性，常用的指标有Goods_coverage、Chao1、Shannon、Simpson和Observed_species指数。Goods_coverage指数主要反映操作分类单元(OTU)覆盖情况，其值高于98%说明覆盖率高、数据量够，Observed_species、Chao1指数与菌群中物种数目成正比，Shannon、Simpson指数与菌群中物种丰度和均匀度成正比[25]。本试验中，试验前期和后期盲肠菌群Goods_coverage指数均高于98%，说明本次盲肠菌群测样数据符合统计学要求；饲粮中添加3种不同剂量水飞蓟素均显著提高了肉鸡前期的盲肠菌群Chao1、Shannon、Simpson和Observed_species指数，表明饲粮中添加水飞蓟素能显著提升肉鸡前期盲肠菌群中物种数量、丰度和均匀度，优化菌群结构。

本试验中，我们从门水平和属水平上探讨了饲粮中添加水飞蓟素对肉鸡盲肠菌群物种组成的影响，结果表明，试验前期，饲粮中添加3种不同剂量水飞蓟素均显著增加了Firmicutes相对丰度，Firmicutes相对丰度的改变主要是由于Faecalibacterium相对丰度的增加；饲粮中添加3种不同剂量水飞蓟素降低了Bacteroidetes相对丰度，Bacteroidetes相对丰度的改变主要是由于Alistipes相对丰度的降低。Faecalibacterium具有肠黏膜保护作用，能通过上调闭锁小带蛋白-1(ZO-1)的表达修复肠黏膜屏障结构[26]。有研究显示，肠道中Alistipes相对丰度与血清IL-6含量呈正相关[27]，表明Alistipes参与机体炎症性疾病的发生。此外，Alistipes与促进回肠炎症有关[28]。因此，饲粮中添加水飞蓟素或能通过提高盲肠Faecalibacterium相对丰度改善肠黏膜屏障，减少Alistipes相对丰度，抑制炎症。本试验中，饲粮中添加水飞蓟素降低了AF12相对丰度，AF12是理研菌科(Rikenellaceae)的细菌，有研究表明，Rikenellaceae相对丰度与银屑病病理特征呈正相关，且与丙酸含量呈负相关[29]。肠道微生物来源的丙酸可通过增加黏蛋白和杯状细胞分泌产物来加强肠道黏液屏障，因此，水飞蓟素能通过抑制肠道Rikenellaceae中AF12相对丰度从而增加肠道环境中丙酸含量，进而维护肠道健康。试验后期，饲粮中添加中剂量水飞蓟素提高了Blautia相对丰度，有研究表明，Blautia是广泛存在于动物粪便和肠道中的益生菌[30]，其能通过增加肠道Treg数量和产生短链脂肪酸维持肠道环境平衡和预防炎症[31]，因此，饲粮中添加中剂量水飞蓟素能通过促进Blautia生长继而有益于肠道健康。此外，试验后期，饲粮中添加高剂量水飞蓟素降低了Tenericutes相对丰度，Tenericutes可以上调糖苷水解酶的活性以促进多糖的降解，并具有产生氢气的潜力，是一种有益菌[32]。因此，本试验结果提示，试验后期饲粮中添加高剂量水飞蓟素会降低盲肠有益菌数量，对肠道产生一定程度的不利影响。

对饲粮中添加水飞蓟素的肉鸡盲肠菌群进行了线性判别分析分析，结果发现，试验前期CON组出现优势菌属Alistipes、HB2_32_21、AF12和Colwellia，S250组出现优势菌属Faecalibacterium和Oscillospira，S500组出现优势菌属Lactobacillus；试验后期S250组出现优势菌属Bifidobacterium，S500组出现优势菌属Anaerofustis。HB2_32_21和Colwellia多存在于海洋湖泊中[33-34]，目前有关二者的功能性研究较少，HB2_32_21和Colwellia对于肠道的影响还有待探讨。Oscillospira在肠道可产生丁酸为主的各种短链脂肪酸[35]，肠道微生物产生的丁酸介导小肠发育和黏膜屏障完整性增强，促进鸡肠上皮细胞增殖[36]，因而饲粮中添加低剂量水飞蓟素可通过提高前期肉鸡盲肠优势菌属Oscillospira的相对丰度继而增强肠黏膜屏障。Lactobacillus可激活Wnt/β-连环蛋白(β-catenin)途径诱导肠干细胞向潘氏细胞分化，增强抗菌肽的表达以抑制有害菌的肠道定植[37]；Bifidobacterium的代谢产物通过激活芳香烃受体和羟基羧基受体3以剂量依赖性的方式调控CD4+T细胞和单核细胞，继而参与肠道免疫反应[38]；Anaerofustis是肠道的产丁酸菌[39]，因此，其也可以同Oscillospira一样通过产生丁酸刺激鸡肠上皮细胞增殖和调节肠道黏液屏障的修复[36]。因而，水飞蓟素可通过增加盲肠Lactobacillus、Bifidobacterium和Anaerofustis相对丰度提高肉鸡肠道免疫功能。

综上所述，饲粮中添加水飞蓟素可促进盲肠有益菌生长，抑制有害菌繁殖，优化肉鸡肠道菌群组成。

4 结 论

饲粮中添加水飞蓟素可以提高快速型黄羽肉鸡肝脏抗氧化能力和空肠黏膜免疫功能，优化盲肠菌群结构。试验前期和后期均以饲粮中添加中剂量(500 mg/kg)水飞蓟素为宜。