响应面法优化姜根多酚类成分提取及纯化工艺

＊肖湲 胡露 陈杰 聂艳峰 郭朝万

（广东丸美生物技术股份有限公司 广东 510530）

引言

姜为多年生草本植物姜（Zingiberoffi cnale Rosc.），其根茎是一种重要的调味品，也是我国传统的药食同源植物[1]。姜酚是姜中一类具有生物活性的酚类化合成分，由于苯环的取代基不同、位置不同及侧链长短、环化与否等差异，组成了许多分子质量不同、分子结构仅略有差异的不同姜酚类物质，包括6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚、12-姜酚等，其中6-姜酚含量最高[2]。姜酚中苯环和长链烃的结构决定其易溶于有机溶剂体系，难溶于水[3]。在提取过程中姜酚成分在加热、酸、碱及其他氧化剂存在的环境下极易发生降解反应、脱水反应和氧化反应，这些均给其分离、提纯工作带来了很大的难度[4]。此外，姜酚中苯环上含有的甲氧基、酚羟基等结构的破化也会影响到姜酚的原本的生物活性[5]。

目前姜酚提取的方法主要有溶剂浸提法[6]、压榨法[7]、超声波辅助提取法[8]、微波辅助提取法[9]、超临界CO2萃取法和渗漉提取法[10]。其中，超声波提取技术具有提取速度快、选择性好、操作方便及有利于活性成分的保留等特点。经过溶剂提取的姜酚成分往往还存在较多的杂质，因此还需要合适的分离方式纯化姜酚。在姜酚的分离纯化研究中最常见的就是大孔树脂吸附法[11]、硅胶柱层析法[12]、高速逆流色谱法[7]等，本文采用单因素和响应面实验方法优化生姜中多酚成分的提取工艺，为姜酚的工艺生产提供理论指导。

1.材料和仪器

（1）材料：姜根，购于市售新鲜样品，于冷冻干燥离心机冻干后再进行提取；试剂：没食子酸、福林酚、碳酸钠、蒸馏水、乙醇。

（2）仪器：紫外分光光度计UV-2600（日本，岛津）、万分之一天平（德国，赛多利斯）、中药粉碎机（淄博粉体设备有限公司）、数显恒温水浴锅HH系列-1型、电热恒温鼓风干燥箱（DGG-9023A）、冷冻干燥离心机（FD-2A-80）、超声仪380W。

2.实验方法

(1)多酚标准曲线的绘制

以没食子酸作为标准对照。分别配制质量浓度为0.05 mg/mL、0.1mg/mL、0.15mg/mL、0.2mg/mL、0.25mg/mL、0.3mg/mL的没食子酸乙醇溶液，分别取2mL加入1mL福林酚试剂，摇匀后静置30s，加入2mL 12% Na2CO3，用蒸馏水定容至20mL，摇匀，在765nm处测定吸光度值，以质量浓度为横坐标，吸光值为纵坐标，制定标曲。本实验得到的标准曲线方程为：A=0.0089c+0.0858，R2=0.997，没食子酸质量浓度在0.05～0.3mg/ml范围内呈现良好的线性范围。

(2)多酚成分提取单因素实验

根据预实验结果，实验基本设定为取生姜粉末1g，加入75%乙醇20mL，功率100%，在50℃下，超声提取20min，4500r离心4min，得到滤液，按以上方法测定姜酚含量。实验因素条件为：料液比（1:5、1:10、1:15、1:20、1:25）、提取时间（10min、15min、20min、25min、30min）、提取温度（30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃）、乙醇体积分数（55%、60%、75%、80%、95%）。

(3)多酚成分提取响应面实验

基于上述单因素实验结果，进一步采用Design-Expert 8.0.6软件设计Box-Behnken中心组合实验设计，主要分析了料液比（A）、乙醇体积分数（B）、提取时间（C）3个因素之间的相互作用对姜酚得率（Y）所产生的影响。试验因素与水平设计见表1。

表1 响应面分析实验因素及水平表

3.结果与分析

(1)单因素实验优化

①研究提取料液比对姜酚提取得率的影响

由图1A可知，在一定的料液比范围内，随着料液比的增加，姜酚的溶解度也随之增大，从而使得总多酚含量也随之增加，在料液比1:25的条件下，总多酚得率达到最高，再随着料液比的增加，多酚可能由于杂质的析出而溶解度下降，从而使得得率也相应下降，因此在料液比1:25的条件下，提取率相对最高。

图1 提取条件单因素试验结果

②研究提取时间对姜酚提取得率的影响

由图1B可知，随着提取时间的增加，总多酚含量呈现先增加后下降的趋势，在时间20min达到最高点，而时间超过20min之后，超声波的作用也会破坏姜酚中的一些不稳定成分，从而降低总多酚的含量。

③研究提取温度对姜酚提取得率的影响

如图1C所示，为了避免多酚成分在高温作用下氧化破化，选择温度在30～70℃下提取，通过温度变化可以发现，温度在50℃提取条件下，更加有利于多酚成分的释放，同时也避免了多酚成分的破化，从而在50℃下，提取率达到最高。

④研究乙醇体积分数对姜酚提取得率的影响

如图1D所示，随着乙醇体积分数的变化，姜酚提取得率随着乙醇体积分数的增加先增加后下降，当乙醇体积浓度为75%时，姜酚提取得率相对最高。而当乙醇体积浓度超过75%后，可能由于生姜细胞中的色素、杂质等脂溶性成分的溶出量增加，导致多酚的溶解度下降。因此选择乙醇体积浓度75%较为合适。

(2)响应面结果与分析

①响应面数据处理

响应面数据结果如表2所示，以料液比A，时间B，乙醇体积分数C为自变量，以姜酚得率Y为响应值，通过软件进行多元回归方程拟合发现：得到自变量与因变量的回归方程：Y=0.53-0.084×A-0.059×B-0.041×C-0.041×A×B-0.059×A×C-0.012×B×C-0.18×A2-0.19×B2-0.19×C2，同时由表3所知，回归模型的P值小于0.01，说明该模型具有显著性，一次项中的A料液比总多酚得率有显著影响；二次项A^2、B^2、C^2影响极显著；各因素对得率的影响大小为料液比＞提取时间＞乙醇体积分数。

表2 响应面实验设计结果

表3 响应面回归模型方差分析

续表

②各因素交互作用分析及验证

由图2～图4可知，沿着曲线上各因素的坡度的变化和等高线密度变疏，等高线呈圆型，因此各因素交互关系不显著。同时预测最佳参数：料液比1:30，提取时间20min，乙醇体积分数65%，提取率为1.0%；为考察结果的准确性进行验证实验，选择料液比:1:30，提取时间20min，乙醇体积分数65%，多酚成分实际提取率为（0.98±0.02%），与预测值接近，在该试验模型下得到的最佳工艺条件具有一定的参考价值，有待于进一步工艺生产放大验证。

图2 料液比与时间的交互作用

图3 料液比与乙醇体积分数的交互作用

图4 乙醇体积分数与时间的交互作用

3.结论

本实验以姜酚得率为评价指标，通过单因素实验得到，当料液比为1:25，提取时间为20min，提取温度为50℃，乙醇体积分数为75%，超声提取功率为90%（342W）的条件下，总多酚的提取得率达到最高1.52±0.05%，同时运用响应面优化三因素（料液比，乙醇体积分数，提取时间）对姜根多酚提取率的影响力依次为料液比＞乙醇体积分数＞提取时间，结合软件分析，并对二次多项回归方程模型的最佳条件进行验证，在实际操作时，将各工艺参数修正为：乙醇体积分数65%，料液比1:3，提取时间为20min。通过试验验证得到总多酚提取率为（0.98±0.02%），实际值与预测值十分接近，模型建立基本成功。