抑制分离缺陷基因3 表达的宫颈癌细胞增殖、凋亡、侵袭及迁移能力观察

刘迎嘉

新疆医科大学第五附属医院病理科，乌鲁木齐830011

宫颈癌是全球女性最常见的恶性肿瘤之一，也是欠发达国家女性癌症死亡的第三大原因［1］。近年宫颈癌的发病率呈逐渐上升和年轻化趋势［2］。新疆是宫颈癌的高发地区，维吾尔族女性宫颈癌的发病率、病死率均较高。晚期复发宫颈癌患者的预后差，其主要原因为肿瘤细胞的侵袭、转移。细胞间黏附丧失和细胞极性改变是导致肿瘤细胞侵袭、迁移的关键原因。分离缺陷基因3（PARD3）的产物是一种紧邻细胞质膜肌动蛋白网络层的极性蛋白，在肿瘤的发生发展进程中起重要作用。研究［3］显示，缺氧可导致蛋白激酶Cζ（PKCζ）/PARD3/PARD6 转录因子表达下调，诱导肺癌细胞的迁移、侵袭。人乳腺癌细胞株MDA-MB-231、SK-BR3 中均存在GAB1 过表达，加强GAB1 与PARD3 的互相作用，最终导致PARD/αPKC 极性蛋白复合物解离，促进细胞上皮间质转化，促进肿瘤的转移［4］。酪氨酸激酶2（Janus Kinase 2，JAK2）是非受体型酪氨酸蛋白激酶（Janus激酶）家族的一员，多种细胞因子和受体结合后可以磷酸化激活JAK2，进一步磷酸化下游靶蛋白的络氨酸残基，从而调控下游基因的转录，在癌细胞的增殖、分化、凋亡过程中发挥调控作用［5-6］。但目前PARD3 在宫颈癌侵袭、转移中的潜在分子机制尚不清楚，PARD3是否通过调控p-JAK2表达在宫颈癌的侵袭转移中发挥调控作用相关研究较少。2021 年2月起，我们观察了抑制PARD 3 表达的宫颈癌细胞系SiHa 的增殖、凋亡、侵袭、迁移能力变化，并探讨PARD3、p-JAK2 对SiHa 细胞侵袭、转移中的调控作用机制，现将结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 细胞、试剂及仪器 人宫颈癌细胞系SiHa 细胞（Cell Bank of the Chinese Academy of Science，Shanghai，China）培养于含10%胎牛血清的DMEM（41500034，Gibco）培养基中，细胞的密度达到80%时按1∶3 的比例传代，37 ℃、5% CO2饱和湿度条件下扩大培养。

1.2 PARD 3siRNA 腺病毒真核载体制备 以前期实验室保存的PARD3 质粒为模板，针对PARD3 全部转录本设计siRNA1 和siRNA 2（Ribobio，guangzhou，China）序列分别为GAAGGTCTATGTCTACTGA 及GAAACAGCGTTGGATGATA。在目的片段两端添加上相应的酶切位点，进行PARD3 目的片段PCR 扩增。将PARD3PCR 产物和目的载体pRS-AD-1 用Asc1、Pme1 分别进行酶切，T4 DNA ligase 连接PCR 产物及目的载体。挑取单菌落进行菌落PCR，将PCR鉴定呈阳性的克隆接到LB液体培养基中，摇菌过夜，次日抽提质粒。进行腺病毒载体的重组及鉴定大量扩增穿梭质粒pRS-AD-1-PARD3 和骨架质粒pRS-AD-2-MCS-RFP，以PacⅠ单酶切重组病毒质粒，37 ℃孵箱放置4 h。制备PARD 3siRNA1（抑制PARD3 基因表达）、PARD 3siRNA2（抑制PARD3 基因表达），同时以骨架质粒pRS-AD-2-MCS-RFPp-JAK2作为siRNC空白对照。

1.3 SiHa 细胞分组及PARD 3siRNA 腺病毒真核载体转染方法 取处于对数生长期生长状态良好的SiHa 细胞分为siRNA1 组、siRNA2 组、siRNC 组，以2×105/孔接种于细胞培养6 孔板，每组6 个复孔，37 ℃、5%CO2培养箱中培养过夜。用100 μL无血清opti-MEM分别稀释10 μL 的PARD 3siRNA1、PARD3siRNA2、siRNC，加入混合LipofectamineTM2000 和siRNA 的稀释液，每个培养孔加混合液200 μL培养。

1.4 三组细胞增殖、凋亡情况观察 ①三组细胞增殖情况观察：培养48 h 时采用CCK-8（E606335-0100，上海生工）法观察细胞增殖情况。取三组细胞，37 ℃、5% CO2培养箱中培养，培养6 h 吸出混合液换入完全DMEM 培养基，37 ℃、5% CO2培养箱中培养；分别于培养24、48 h 时每孔加入10 μL CCK8溶液，37 ℃培养4 h，采用酶标仪测算各孔细胞的光密度OD450 值，以OD450 值代表各组细胞的增殖情况。②三组细胞凋亡情况观察：培养48 h 时取三组细胞，用不含EDTA 的0.25%胰酶消化细胞，终止消化后收集细胞；用PBS 将细胞润洗2 次，1 500 r/min离心5 min；按照AnnexinV-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒（40302ES20，USA）说明进行操作，最后流式细胞仪上机检测，测算三组细胞凋亡情况。重复3次，取平均值。

1.5 三组细胞迁移、侵袭情况观察 培养48 h时取各组细胞。①在24 孔板中预先加入800 μL 10%FBS 的DMEM 培养基（含双抗），放入Transwell 小室，培养1 h 在Transwell 上室分别接入200 μL 各组细胞悬液，37 ℃、5% CO2培养箱培养。取出Transwell，PBS 清洗。用干净的棉球将上室一侧的未迁移的细胞擦干净，显微镜下观察并进行细胞迁移计数，各组细胞迁移相对数量=各组迁移细胞数/siRNC 组迁移细胞数×100%；②在24 孔板中加入4 ℃预冷800 μL 10% FBS DMEM 培养基（含双抗），放入Transwell 小室，在Transwell 小室上室底部中央垂直加入100 μL终浓度为1 mg/mL 的Matrigel，37 ℃温育4～5 h 使其干成胶状，待Matrigel 干成胶状后在Transwell 上室分别接入200 μL 各组细胞悬液，37 ℃、5% CO2培养箱培养，取出Transwell，PBS清洗。用干净的棉球将上室一侧的未迁移的细胞擦干净，显微镜下观察并进行细胞侵袭计数，各组细胞侵袭相对数量=各组侵袭细胞数/siRNC 组侵袭细胞数×100%。重复3次，取平均值。

1.6 三组SiHa 细胞PARD3、JAK2 mRNA 检测 采用qRT-PCR 法。转染后即刻采用TRIzol 法提取三组SiHa细胞总RNA。合成逆转录反应体系，逆转录成cDNA。实时荧光定量PCR 检测，反应体系为20 μL，反应条件为95 ℃预变性2 min、95 ℃变性15 s、60 ℃退火1 min，反应40 个循环。GAPDH 上游引物5’-TCAAGAAGGTGGTGAAGCAGG-3’；下游引物5’-TCAAAGGTGGAGGAGTGGGT-3’。PARD3上游引物5‘-AGGGAGGCCCTTCTATTCCT-3’；下游引物5’-TGCCTACACCGCTTAAAGGC-3’。JAK2 上游 引 物5′-GTCATGGCCCCAATTTCGATGCC-3′；下游 引 物5′-TCGCTCGACAGCAAAAGTCA-3′。绘 制溶解曲线，以标准曲线法测算各组PARD3 及JAK2 mRNA的相对表达量。实验重复3次，取平均值。

1.7 三组SiHa 细胞PARD3、JAK2 蛋白检测 采用Western Blotting 法。分别于培养24、48 h 时适量取各组细胞，应用RIPA 裂解液（Beyotime）提取总蛋白，BCA 蛋白定量后样品加样，每孔上样SiHa 细胞蛋白15 μg 进行SDS-PAGE 电泳。然后转印至PVDF 膜，用含5% 脱脂奶粉的TBST（封闭液）浸泡PVDF 膜，室温摇床封闭2 h。用封闭液稀释相应的一抗PARD3（Ab64646，abcam）、JAK2（3230，CST），使PVDF 膜浸泡于一抗孵育液中，4 ℃孵育过夜。使PVDF 膜浸泡于二抗孵育液中，37 ℃摇床孵育2 h，洗去多余二抗。显色曝光、扫描胶片，用BandScan分析胶片PARD3灰度值，以胶片灰度值代表PARD3的相对表达量。于培养48 h 时候取三组细胞Western Blotting 法测算三组细胞JAK2、p-JAK2 蛋白的相对表达量。重复3次，取平均值。

1.8 统计学方法 采用GraphPad Prism5 软件进行统计学处理。采用P-P 图检验计量资料的正态性，呈正态分布的计量资料用以表示，组间比较采用单因素方差One-wayANOVA分析，其中细胞增殖数据采用Two-wayANOVA分析。P＜0.05 为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 不同时间三组细胞OD450 值、细胞凋亡率比较 培养24 h 时siRNC 组、siRNA1 组、siRNA2 组细胞的OD450 值分别为1.07 ± 0.04、1.00 ± 0.05、1.02 ± 0.03；培养48 h 时siRNC 组、siRNA1 组、siRNA2 组细胞的OD450 值分别为1.37 ± 0.04、1.50 ±0.04、1.66 ± 0.04。与siRNC 组比较，培养24、48 h时siRNA1 组、siRNA2 组细胞的OD450 值增加（P均＜0.05）。siRNC 组、siRNA1 组、siRNA2 组细胞凋亡率分别为6.813% ± 0.571%、16.443% ±0.375%、23.020% ± 0.284%，与siRNC 组比较，siRNA2组细胞凋亡率降低（P＜0.05）。

2.2 三组细胞迁移、侵袭数比较 培养48 h 时siRNC 组、siRNA1 组、siRNA2 组细胞迁移数分别为100.000 ± 7.051、122.300 ± 4.290、129.200 ±7.086，细胞侵袭数分别为100.000 ± 9.039、120.500 ± 5.837、131.300 ± 7.903，与siRNC 组比较，siRNA1 组、siRNA2 组细胞迁移数、侵袭数增加（P均＜0.05）。

2.3 三组SiHa 细胞PARD3、JAK2 mRNA 相对表达量比较 siRNC组、siRNA1组、siRNA2组PARD3mRNA相对表达量分别为1.009 ± 0.147、0.676 ± 0.154、0.396 ± 0.091，JAK2mRNA相对表达量分别为1.015 ± 0.182、1.204 ± 0.265、1.030 ± 0.284；与siRNC 组比较，siRNA1 组、siRNA2 组PARD3 mRNA相对表达量低（P均＜0.05）；与siRNA1 组比较，siRNA2组PARD3 mRNA相对表达量低（P＜0.05）。

2.4 三组SiHa 细胞PARD3、JAK2、p-JAK2 蛋白相对表达量比较 培养24 h 时siRNC 组、siRNA1 组、siRNA2 组PARD3 蛋白相对表达量分别为100.000 ± 4.687、104.000 ± 4.488、118.000 ±4.741，培养48 h 时siRNC 组、siRNA1 组、siRNA2 组PARD3 蛋白相对表达量分别为100.000 ± 3.611、70.840±1.482、49.640±0.993，与培养24 h 比较，培养48 h 时siRNA1 组、siRNA2 组PARD3 相对表达量下降（P均＜0.05），因此后续实验选取转染48 h为最优处理时间。培养48 h 时siRNC 组、siRNA1 组、siRNA2 组JAK2 蛋白相对表达量分别为100.000 ±3.313、101.900 ± 1.403、102.100 ± 0.899；p-JAK2蛋白相对表达量分别为100.000 ± 5.487、174.700 ± 11.650、220.400 ± 5.757，与siRNC 组比较，siRNA1组、siRNA2组p-JAK2蛋白相对表达量均增加（P均＜0.05）。

3 讨论

在侵袭过程中肿瘤细胞通过丧失细胞间粘附能力，获得运动的潜能，离开原发肿瘤部位浸润到邻近组织及脉管系统，最终导致远处转移。细胞间相互连接作用减弱，细胞失去细胞间黏连并改变细胞极性，往往是导致肿瘤细胞发生侵袭、迁移的关键原因，而上皮细胞极性主要是依靠极性蛋白来调控的［7-8］。

Par/αPKC 极性蛋白复合物紧邻细胞质膜的肌动蛋白网络层，建立和维持了细胞极性。一旦极性蛋白之间的平衡失调，则会破坏细胞极性，诱导肿瘤的发生、增殖及迁移。PARD3 是Par 极性蛋白家族的主要调节因子。研究［4，9-10］显示，PARD3 在乳腺癌、甲状腺癌等多种肿瘤中扮演着肿瘤抑制者的角色，随着PARD3 平衡的改变，肿瘤表现出强的侵袭转移复发倾向。ZHAO 等［9］研究发现，在Luminal A亚型乳腺癌中，PARD3 下调与较短的无复发生存期相关。转录因子Sp1 结合到PARD3 启动子区域并诱导了PARD3 的表达，Sp1 低的乳腺癌患者RFS 明显降低，抑制PARD3可促进乳腺癌细胞的迁移和侵袭。过表达PARD3 部分逆转Sp1 敲除诱导的迁移和侵袭，说明极性蛋白PARD3的下调受多种基因调控并与ER阳性乳腺癌患者预后不良相关。

ZHANG 等［10］发现在80 个甲状腺肿瘤样本中，MicroRNA 483-3p（miR-483）上调，PARD3 下调，无病生存期降低。过表达miR-483 可诱导细胞生长、迁移和侵袭。抑制miR-483 使PARD3 表达增加，抑制TGF-β1诱导的细胞迁移和侵袭降低。双荧光素酶报告基因检测结果表明，miR-483 靶向抑制时，PARD3 表达下调。TGF-β1可诱导上皮间充质转化及Tiam1-Rac 信号转导，过表达PARD3 可降低TGFβ1的表达。PARD3降低了EMT和Tiam-Rac1信号的抑制，这是由miR-483 转染ATC 细胞引起的。结果表明，PARD3 下调导致ATC 细胞侵袭和EMT 增加，miR-483可促进细胞侵袭和EMT。

本实验采用qRT-PCR和蛋白印迹法分别检测转染后siRNC组、siRNA1组及siRNA2组PARD3 mRNA含量和蛋白相对表达量，与siRNC 组相比，siRNA1组和siRNA2 组PARD3 mRNA 均显著降低，与siRNA1 组相比siRNA2 组PARD 3mRNA 相对表达量下降更显著，差异均有统计学意义。转染后48 h siRNA1 组和siRNA2 组的PARD3 蛋白表达量显著下降，分别为70.84%和49.64%，尤以siRNA2 组下降更为显著。以上两种实验方法检测结果一致，说明本实验设计腺病毒真核载体siRNA-PARD3 转染实验成功；筛选的2 条siRNA 基因转录本中siRNA2 转染效果更明显，可以更显著降低PARD3 mRNA 及蛋白含量，为将来更深一步的研究提供基因转录本的实验依据。

本研究结果发现，培养24、48 h 时各组siHa 细胞的OD450 值都有显著增加，随着观察时间的延长，培养48 h 时OD450 值则显著增加，说明抑制PARD3 能够促进宫颈癌SiHa 细胞增殖，并且抑制PARD3 RNA表达越明显，细胞增殖越快。流式检测细胞凋亡发现，培养48 h 后SiHa 细胞凋亡百分比减少，与对照siRNC 组相比，siRNA2 组细胞凋亡率降低有显著性差异，说明siRNA2 组能有效抑制SiHa细胞的凋亡。Treanswell小室和Matrigel实验结果均显示干扰PARD3 基因表达的SiHa 细胞侵袭迁移数量增多，与对照组相比差异有统计学意义，说明沉默PARD3 后SiHa 细胞侵袭迁移能力增强。本实验结果提示PARD3 的下调可能在宫颈癌发生发展中的发挥重要作用。

JAKs/STAT3 通路的异常激活是多种恶性肿瘤的一个特征。JAKs/STAT3 信号转导途径的激活在免疫系统的调节、促进细胞增殖、分化、发育、生存等方面都发挥重要作用，与肿瘤的发生发展也有着密切的关系。STAT3 的上游因子JAK2，不仅作为原激酶介导其磷酸化，而且在大多数肿瘤活化中都起到关键作用［11］。一项研究［12］用JAK1，2 抑制剂处理ATM 基因沉默的非小细胞肺癌A549cisR 和H157cisR 细胞株，结果发现肿瘤细胞侵袭能力减弱，上皮钙粘附蛋白表达升高，神经钙粘附蛋白、波形蛋白和转录因子Snail表达降低，与细胞侵袭能力一致，提示ATM 通过JAK 1，2/STAT 3 途径下调PD-L1，介导顺铂耐药的A549cisR 和H157cisR 细胞的EMT和转移。

SHEN 等［13］通过调节长链非编码RNA HOST2（人卵巢癌特异性转录本2）和抑制JAK2/STAT3 信号通路，研究异丙酚对人卵巢癌细胞ES2 和OVCAR-3体外生长的影响，结果发现ES-2和OVCAR-3细胞的细胞活力和细胞内HOST2 的表达随异丙酚浓度的增加而逐渐降低，且呈剂量依赖性。与异丙酚组相比，过表达HOST2 显著促进细胞增殖、迁移、侵袭，抑制细胞凋亡，改善异丙酚对肿瘤细胞生长的抑制作用。与异丙酚组相比，pcDNA-HOST2 组Bcl-2 表达显著升高，Bax 表达显著降低，Cleaved caspase3/caspase3 比值显著降低。过表达HOST2 显著提高了JAK2 和STAT3 的磷酸化水平，降低了异丙酚对JAK2/STAT3 信号通路的抑制作用。HUANG等［14］研究癌症相关区域长非编码RNA-7（CARLo-7）在膀胱癌发生发展中的作用机制时，发现CARLo-7在膀胱癌组织和细胞系中表达显著上调。sh-CARLo-7沉默CARLo-7 可显著抑制膀胱癌细胞增殖并诱导细胞凋亡，而强化CARLo-7 表达则促进细胞增殖。同时，沉默CARLo-7 可减弱膀胱癌细胞的迁移、侵袭和EMT，而过表达CARLo-7 则有相反的效果。通过下调CARLo-7、β-catenin、p-JAK2和p-STAT3 mRNA和蛋白水平降低，而Wnt/β-catenin 或JAK2/STAT3通路的激活则消除了CARLo-7 下调对细胞增殖和迁移的影响。以上研究均提示肿瘤细胞的增殖迁移侵袭调控机制可能是通过抑制JAK2/STAT3 信号通路的激活来实现的。

本研究中siRNAPARD3 转染SiHa 细胞48 h 后，与siRNC组相比，siRNA1组和siRNA2组JAK2 mRNA含量和JAK2总蛋白表达量无明显变化，差异无统计学意义。但是p-JAK2的蛋白相对表达量增加，其中siRNA2 自P-JAK 表达升高更明显更显著，说明沉默PARD3 上调磷酸化的JAK2，激活下游磷酸化信号转导通路从而调控SiHa 细胞增殖凋亡迁移侵袭，促进宫颈癌恶性进展。以上结果显示，PARD3 基因沉默后可以上调Tyr931 磷酸化的JAK2 并且促进了肿瘤细胞的增殖、侵袭转移，抑制了细胞凋亡，提示抑制PARD3表达可能通过调节JAK2 Tyr931磷酸化信号通路，促进SiHa 细胞的侵袭，从而加速SiHa 肿瘤的发生发展，PARD3 和JAK2 共同在SiHa 细胞侵袭迁移中发挥重要的作用。

综上所述，抑制PARD3 表达的SiHa 细胞PARD3 mRNA 和蛋白相对表达量均降低，p-JAK2蛋白相对表达量升高，细胞增殖能力升高、细胞凋亡抑制、侵袭迁移能力增强。PARD3 很可能通过调节SiHa JAK2 的磷酸化表达水平促进宫颈癌细胞SiHa的增殖、侵袭及迁移，抑制细胞凋亡。