2 型糖尿病伴牙周炎患者龈下菌斑的菌群结构及功能分析

杨岚，张佳明，方梅飞，黄玉晓，蒋兰岚，陶人川

1 广西医科大学附属口腔医院牙周粘膜科，南宁 530000；2 广西壮族自治区卫生健康委员会口腔感染性疾病防治重点实验室；3 广西口腔颌面修复与重建研究自治区级重点实验室；4 颌面外科疾病诊治研究重点实验室；5 广西颅颌面畸形临床医学研究中心

2 型糖尿病是一种环境和/或遗传因素引起的，以糖代谢异常为主要特征的慢性疾病［1］。我国是目前全球患糖尿病人数最多的国家，其中90%以上的患者为2 型糖尿病［2］。临床研究［3］表明，2 型糖尿病可升高牙周炎的患病风险及病情严重程度，牙周炎也可影响患者的血糖控制［4-5］。口腔微生物是糖尿病与牙周炎相互作用的联系机制之一，微生物可通过各种酶、毒素及代谢物等发挥炎症作用，促进2型进糖尿病发展，同时糖尿病引起的人体IL-17上调可导致口腔微生物群的致病性更强［6］。近年来逐渐有学者［7］采用16S rDNA 扩增子测序技术分析健康牙周状态与牙周炎症状态下的龈下微生物显著差异，但16S rDNA 测序技术往往只能检测到菌属或部分菌种，精确度有限。随高通量测序技术的发展，鸟枪法宏基因组测序技术能鉴定更多的物种并进一步分析微生物基因编码的各项功能［8］。目前，关于2型糖尿病伴牙周炎患者龈下菌斑微生物群落结构组成及其功能相关报道较少。为此，我们运用鸟枪法宏基因组测序技术，对2 型糖尿病伴牙周炎患者龈下菌斑中的菌群结构及功能进行分析，现将结果报告如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择2019 年7 月—10 月在广西医科大学附属口腔医院牙周黏膜科就诊的单纯牙周炎患者3 例、广西医科大学第一附属医院内分泌科门诊就诊的2 型糖尿病患者包括伴牙周炎患者2 例不伴牙周炎患者2 例，及性别及年龄相匹配的健康志愿者3 例。2 型糖尿病患者包括伴牙周炎患者年龄（65.50±9.89）岁，空腹血糖（6.90±0.14）mmol/L，糖化血红蛋白C（HbAlc）6.66%±0.51%，牙周探诊深度PD（4.32 ± 1.52）mm，附着丧失AL（4.53 ±1.40）mm；2 型糖尿病不伴牙周炎患者年龄（66.50±2.12）岁，空腹血糖（5.48±0.18）mmol/L，HbAlc6.11%±0.27%，PD（2.46±0.07）mm；单纯牙周炎患者年龄（47.67 ± 3.79）岁，空腹血糖（5.30 ±0.26）mmol/L，HbAlc ＜6.50%，PD（4.55 ±0.57）mm，AL（4.55 ± 0.57）mm；健康志愿者年龄（46.00±8.72）岁，空腹血糖（5.00±0.26）mmol/L，HbAlc ＜6.50%，PD（2.19 ± 0.09）mm。糖尿病患者纳入标准：①2 型糖尿病病情稳定1 年以上，无其他严重并发症；②3 个月内用药、饮食和运动习惯均无明显改变。牙周炎患者纳入标准：至少两颗不相邻患牙的邻间附着丧失或至少两颗牙的颊唇/舌腭侧临床附着丧失≥3 mm 伴牙周袋＞3 mm。排除标准：①有长期吸烟病史、饮酒史；②口腔或者其他部位有明显急性感染；③3 个月内有使用抗生素、激素；④3 个月内接受过洁治、刮治等牙周治疗；⑤全口天然牙＜20 颗。本研究经广西医科大学伦理委员会批准（伦理号：2020010），与受试者签署知情同意书。

1.2 受试者龈下菌斑菌群结构及功能分析

1.2.1 龈下菌斑采集及细菌DNA 提取 受试者禁食2 h，选取2 型糖尿病伴牙周炎患者与单纯牙周炎患者每个象限牙周袋最深位点为采样位点，随机抽取2 型糖尿病不伴牙周炎患者及健康者4 个位点作为采样位点。清除拟采样牙的龈上菌斑，使用无菌Gracy 刮治器，刮取龈下菌斑，并置入含0.25 mL ddH2O的冻存管中，置入液氮冻存。采用E.Z.N.A.Stool.®DNAKit 试剂盒提取各龈下菌斑样本中的DNA，50 μL Elution buffer 洗脱，1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量，-80 ℃保存备用。

1.2.2 龈下菌斑菌群结构及功能分析 用联川自主研发的试剂盒进行paired end文库构建，文库质检合格后用HiSeq4000 进行高通量测序，测序模式为PE150。文库构建主要步骤如下图所示，包括：基因组DNA 用超声打断、DNA 片段末端修复、加′A′ 碱基至DNA 片段的3’末端、加测序接头、片段选择、PCR扩增、文库质检、上机测序。本部分由联川生物有限公司协助完成。使用cutadapt v1.9软件获取测序数据，利用fqtrim v0.94 软件对低质量的reads 进行裁剪，bowtie2 v2.2.0 软件将reads 与宿主基因组进行比对，去除宿主污染。通过IDBA-UD 软件重新组装经过质量过滤的reads，以构建每个样本的宏基因组。利用MetaGeneMark v3.26软件预测宏基因组contigs 的所有编码区域（CDS，Coding Region），根据预测结果进行过滤和去冗余，随后通过CD-HIT v4.6.1 软件聚类得到unigenes，并计算各基因在每个样品中的丰度信息以估算样本的Unigene 丰度。利用过DIAMOND v 0.7.12 软件对unigenes 与NCBI NR 数据库进行比对，选取evalue≤最小evalue*10 的比对结果进行物种分类。结合NCBI 的物种分类系统，通过与MEGAN 软件相似的LCA（Lowest Common Ancestor）算法，分析菌群的结构。同时将得到unigenes 与KEGG 数据库进行比对，进行功能注释。基于unigenes的分类和功能注释，以及unigenes的丰度谱，在分类或功能水平上进行分析。

1.3 统计学方法 选用SPSS26.0 统计学软件。正态分布检验采用Shapiro-Wilk 检验，符合正态分布的计量资料以表示，两组间比较采用t检验；计数资料以例（%）表示，组间比较采用χ2检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 受试者龈下菌斑的菌群结构 4 组样本检测结果共分类菌种界5 个、门64 个、纲127 个、目246个、科448 个、属1 389 个、种4 697 个。在种水平上分析，2 型糖尿病伴牙周炎患者龈下菌斑中丰度排名前5 的菌种依次为齿垢密螺旋体、牙龈卟啉单胞菌（、中间密螺旋体、福赛坦氏菌、文氏密螺旋体，相对丰富分别为28.47%、23.52%、14.22%、10.74%、10.73%；单纯牙周炎患者龈下菌斑中丰度排名前5的菌种依次为牙龈卟啉单胞菌、齿垢密螺旋体、福赛坦氏菌、索氏密螺旋体、中间密螺旋体，相对丰度为30.84%、27.06%、13.88%、7.62%、7.27%；2 型糖尿病不伴牙周炎患者龈下菌斑龈下菌斑中丰度排名前5 的菌种依次为Actinobaculum sp.oral taxon183、马氏棒状杆菌、戈氏放线菌、齿垢密螺旋体、具核梭杆菌，相对丰度分别为16.91%、15.83%、13.00%、12.21%、12.04%；健康志愿者龈下菌斑龈下菌斑中丰度排名前5 的菌种依次为齿垢密螺旋体、马氏棒状杆菌、Lautropia mirabilis、具核梭杆菌、Actinobaculum sp.oral taxon183，相对丰度分别为18.44%、16.17%、16.10%、12.67%、7.33%。根据龈下细菌的聚集特性，进一步分析龈下菌斑的微生物复合体分布情况，2 型糖尿病伴牙周炎患者及单纯牙周炎患者龈下菌斑中的红色复合体（牙龈卟啉单胞菌、福赛坦氏菌、齿垢密螺旋体）丰度均＞60%，高于2 型糖尿病不伴牙周炎患者和健康志愿者（P均＜0.05）。

2.2 受试者龈下菌斑基因组功能分析 2 型糖尿病伴牙周炎患者、2 型糖尿病不伴牙周炎患者、单纯牙周炎患者及健康志愿者的龈下菌斑基因组注释得到的基因数目分别为3 489、3 116、3 415、3 269 个，差异明显的基因有41 个。将差异表达的基因注释到KEGG pathway，发现四组的阳离子抗菌肽抵抗［Cationic antimicrobial peptide（CAMP）resistance］、甘油脂代谢（Glycerolipid metabolism）、丙酮酸代谢（Pyruvate metabolism）、双组分系统（Two-component system）、碳代谢（Carbon metabolism）、One carbon pool by folate、Terpenoid backbone biosynthesis、DNA修复（DNA replication）、生物素代谢（Biotin metabolism）及ABC 转运系统（ABC transporters）等通路富集有差异，其中双组分系统、碳代谢及ABC 转运系统通路在2型糖尿病伴牙周炎患者的龈下菌斑中富集明显。

3 讨论

2 型糖尿病是最常见的与牙周炎发生发展相关的系统性疾病之一，两者之间的联系主要集中在代谢改变和免疫紊乱，包括氧化应激、免疫系统细胞因子分布的改变和细胞受体的调节等［9］，口腔微生物变化的相关研究比较缺乏。本研究使用高分辨率鸟枪法测序技术，初步探讨龈下菌斑中的菌群结构及功能，从微生物的角度研究2 型糖尿病和牙周炎之间的联系。我们发现2型糖尿病伴牙周炎患者与单纯牙周炎患者的龈下菌群相比较，菌种分布相近。早期研究［10］认为，糖尿病的存在对牙周微生物群的组成无显著影响，而且糖尿病患者的血糖控制水平对龈下生物膜的组成也无显著影响，这可能是由于传统技术如体外培养和DNA-DNA 杂交的局限性，许多低丰富度的物种无法被检测到，存在显著的偏见，不能充分研究微生物多样性。但随着高通量测序技术的出现，有研究［11］通过16S rDNA 测序探索了糖尿病患者牙周微生物组成之间可能的关联，发现了糖尿病患者龈下微生物组成不同的证据。

我们前期通过16S rDNA 测序也发现各组微生物组成在门、属等层面存在差异。此次采用宏基因组鸟枪法测序技术进行菌种分析，发现在菌种层面2 型糖尿病对龈下菌群分布无显著影响。牙龈卟啉单胞菌是牙周炎病变区最主要的致病菌，单纯牙周炎患者龈下菌斑中的牙龈卟啉单胞菌相对丰度高于2型糖尿病伴牙周炎患者，这可能是2型糖尿病患者对牙周病原体耐受性，能较早地表现出牙周炎状态［12］。按龈下细菌的聚集特性及与牙周状况的关系，通常将龈下细菌分为6个主要复合体［13］，分别以红、橙、黄、绿、紫、蓝表示，与牙周炎的紧密相关关系度由高到低排列［14］。进一步比较有无牙周炎患者的龈下微生物发现，与牙周炎发生密切相关的红色复合体在2型糖尿病伴牙周炎和单纯牙周炎患者中呈高丰度的趋势。健康志愿者和2型糖尿病不伴牙周炎患者的红色复合体呈低丰度分布，且无明显差异。上述结果表明2型糖尿病对牙周病复合体的分布可能无显著影响。

本研究进一步分析2 型糖尿病伴牙周炎患者龈下菌斑中的菌群在不同疾病状态下富集明显的功能通路，这些通路主要涉及能量代谢、脂代谢、氨基酸代谢，是微生物的重要代谢途径。其中信号传导途径双组分调节系统、碳代谢及ABC 转运系统通路在2 型糖尿病伴牙周炎患者的龈下菌斑中富集明显。双组分调节系统常见于革兰阴性菌，可灵敏地感知生存环境地变化，帮助微生物适应不同的宿主环境。有研究［15］发现，糖尿病患者唾液中葡萄糖水平升高可导致口腔环境酸化，龈下微生物可能通过上调双组分调节系统的基因表达，从而适应糖尿病对口腔微环境的影响。双组分调节系统还可通过调节IX 型分泌系统的基因表达来调节牙龈卟啉单胞菌中毒力因子的成熟和运输，如牙龈素和肽酰基精氨酸脱亚胺酶等［16］。同时微生物碳代谢过程产生的戊糖、葡萄糖醛酸、抗坏血酸、丁酸盐等代谢物与牙周炎的发展密切相关，其中微生物产生的丁酸盐被认为是牙周炎症的代谢标志［17］，同时丁酸盐也可以影响胰岛素敏感性。ABC转运系统是病原体获取营养的主要运输蛋白，可吸收其生态系统中独特的营养物质，如病原体可通过转运系统吸收形成生物膜的关键成分铁［18］。另外ABC转运系统还编码多种大分子出口，以抵御宿主环境中的抗菌素［19］，说明这些途径可能提供了2型糖尿病和牙周炎之间的联系机制。

综上所述，2 型糖尿病伴牙周炎患者和单纯牙周炎患者龈下菌斑中的菌群结构相似，以红色复合为主，进一步进行龈下菌斑基因组功能发现存在差异，其中与致病相关的功能基因在2 型糖尿病伴牙周炎患者龈下菌斑中富集明显，主要集中在代谢方面。因此，研究龈下菌群代谢的变化情况可能是进一步探讨2型糖尿病与牙周炎之间联系的新方向。