高原环境因素致男性生殖系统氧化应激损伤的机制研究进展

马刚，张凯，常德辉，张斌

1 甘肃中医药大学第一临床医学院，兰州730000；2 中国人民解放军联勤保障部队第九四〇医院泌尿外科

高原是指具有寒冷干燥、低大气压、低氧分压、高太阳辐射等气候特点，海拔位于500 m 以上的地区。研究高原环境因素对人体健康的影响，对于保护高原人群身体健康、促进高原地区顺利发展具有重要意义。高原相关生殖损伤近年来成为学界关注的热点。常德辉等［1］通过实验模拟海拔4 000 m 成功建立高原大鼠生殖系统损伤模型，并且发现，随着海拔高度升高，大鼠生殖功能改变越明显。邓琛耀等［2］分析国内外文献，认为高原低氧环境对男性精液质量影响的机制之一是活性氧（ROS）生成过多。过多的ROS 会损害精子DNA，破坏精子细胞膜结构，加速生精细胞和精子凋亡等。但目前国内外关于高原环境因素对男性生殖系统氧化应激（OS）损伤的研究多数集中于生殖内分泌、生殖系统组织生化代谢和精液参数等现象探讨方面，针对生殖腺组织细胞超微结构和生精细胞、精子损伤及其调控机制的研究比较缺乏，相应抗氧化治疗和预防措施的研究也很少见。现就高原环境因素致男性生殖系统OS损伤的机制相关研究作一综述。

1 生殖内分泌功能OS损伤及机制

睾丸Leydig细胞合成的睾酮对精子的产生至关重要，睾酮浓度高低对精子的质量和数量影响非常大，睾酮浓度降低会导致无精子症、少弱精子症和精子无力症等。而OS对男性性激素如睾酮、雌二醇等的影响主要为抑制作用。OS 反应会损伤Leydig 细胞的线粒体和内质网，诱发细胞凋亡，导致睾酮合成减少。同时睾酮浓度降低会引起线粒体结构和功能异常，Leydig 细胞凋亡增加，形成恶性循环。此外，ROS还会干扰丘脑—垂体—睾丸轴的反馈调节及下丘脑—垂体—性腺轴与其他下丘脑—激素轴之间的相互作用，导致调节男性生殖功能的激素平衡被打破。有研究表明，与平原地区成年男性比较，高原低氧环境中男性体内雌二醇、睾酮水平明显降低，糖蛋白激素抑制素B9 水平明显升高［3］。顾本宏等［4］发现，黄体生成素减少与高原低氧环境暴露时间长短呈正相关，暴露时间越长，黄体生成素生成抑制越明显。同时，LIAO 等［5］发现，高原环境下，血清睾酮水平与低氧诱导因子1（HIF-1）表达呈负相关，认为低氧环境下生精细胞凋亡与血清卵泡刺激素和睾酮含量的减少有重要关系。孔飞燕等［6］通过实验表明，左卡尼汀有助于提高高原低氧组大鼠精子质量，维持睾酮、黄体生成素及卵泡刺激素水平。最近，LIU等［7］研究表明，低压低氧可诱导成年雄性大鼠睾丸瘦素—瘦素受体的表达，提示瘦素—瘦素受体信号可能介导了低氧对雄性大鼠生殖系统的损伤。

2 生殖腺组织细胞结构OS损伤及机制

在高原环境中睾丸组织会产生大量ROS 发生蓄积，抗氧化物质被大量消耗，丙二醛、过氧化氢等含量升高而超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽等水平降低，细胞毒性增加，引起生精上皮细胞脱落，曲细精管管壁变薄，生精细胞和Leydig细胞凋亡增加，睾酮合成和分泌减少，影响精子发生及生殖生理过程。附睾组织中OS会破坏精子成熟，引起附睾指数下降及形态萎缩，显微结构发生明显破坏。FARIAS等［8］为研究持续性慢性低压缺氧和间歇性慢性低压缺氧对雄性大鼠睾丸组织结构及生化代谢的影响，将雄性大鼠暴露在模拟海拔高度4 600 m（PO289.6 mmHg）60 d，发现持续性慢性低压缺氧和间歇性慢性低压缺氧的雄性大鼠在生精周期各阶段都会引起睾丸形态明显变化，如曲细精管管壁变薄、间隙增大，生精上皮细胞空泡化，基底膜折叠和生精细胞凋亡。MADRID 等［9］发现，缺氧最重要的早期变化是睾丸水肿，血浆和睾丸睾酮水平升高，常压缺氧与高原低压缺氧产生的效果相似。同时，常德辉等［10］电镜下观察高原低氧组大鼠睾丸组织，发现睾丸超微结构受损显著，而左卡尼汀可提高大鼠的抗氧化能力，减轻低氧对睾丸组织的损伤。

3 精液精子OS损伤及机制

高原低压低氧环境对精液精子的影响一直是高原生殖损伤研究的焦点。顾本宏等［11］对1 563 例高原地区藏民和藏区汉族移民进行常规精液分析和精子DNA 断裂指数检测，发现在高原低氧环境的适应过程中，藏区汉族移民精子浓度和活力发生适应性变化，无精子症和严重少精子症的发病率均低于本地藏族男性。ZHENG 等［12］研究表明，在3 600 m 海拔高度短期暴露1个月会增加精子畸形的分布。并且，AL-HASHEM 等［13］发现在低压低氧条件下生活可下调干细胞因子表达、降低精子数和血清生殖激素水平，并显著增强睾丸组织OS 和脂质过氧化。PELLICCIONE 等［14］研究表明，高海拔地区的体育锻炼与睾丸功能障碍相关，会导致精子浓度降低，但精子质量健康。动物实验研究显示，卵生动物在极端高海拔缺氧条件下孵育幼体，不会阻止卵生外胚层产生可存活的幼体，但可能对卵生后代的发育造成影响［15］。HE等［16］表明，虽然高原缺氧会对精液质量和生殖激素产生不利影响，但这些影响是可逆的。OS可由一系列内源性和外源性因素触发，高原暴露就是其中之一。ROS是在间歇性慢性低压缺氧的复氧阶段产生的，有助于生理反应的恢复，但当产生的ROS过多，ROS与抗氧化物之间的动态平衡被破坏，则发生OS。OS 会对精子产生诸多不利影响，如脂质过氧化、DNA片段化和凋亡。

3.1 精子脂质过氧化 精子质膜存在丰富的脂质，主要是多不饱和脂肪酸，其亚甲基之间的六个双键是不共轭的。ROS的增加引起精子质膜内多不饱和脂肪酸过氧化，质膜失去了精卵结合所需的膜流动性和完整性，从而导致细胞功能障碍。脂质过氧化除了破坏精子质膜外，其产物还可与电子传递链上的线粒体蛋白结合并破坏其结构，发生电子泄漏，导致线粒体膜电位降低，ATP 产生减少，精子活力降低［17］。脂质过氧化有三个阶段：第一阶段是“引发”，即ROS 从多不饱和脂肪酸的碳—碳双键中提取氢原子产生脂肪酸基；第二阶段是“扩散”，产生的脂肪酸基与氧快速反应形成过氧脂肪酸基团，当有铜、铁等金属离子存在时，过氧脂肪酸基团可再次从多不饱和脂肪酸中提取一个氢原子，产生脂肪酸自由基和脂质过氧化物；第三阶段是“终止”，这些形成的脂肪酸自由基彼此反应，生成细胞毒性醛和其他终产物。脂质过氧化的主要产物是4-羟基壬烯醛、丙二醛和丙烯醛，其中丙二醛是分析和监测多不饱和脂肪酸过氧化程度的重要生物标志物。

3.2 精子DNA片段化 研究表明，高原环境因素可改变精子核DNA（nDNA）完整性和线粒体DNA（mtDNA）数目［18］。王瑞等［19］研究发现，长期在高原工作会损伤精子nDNA，精液中ROS过量产生和抗氧化物质水平降低所引起的OS 是导致DNA 片段化的原因之一。OS 可通过激活精子半胱氨酸蛋白酶（Caspase）和核酸内切酶直接或间接损伤精子nDNA 而发生DNA片段化。精子从生精小管通过睾丸网转移至附睾尾部的过程中暴露于ROS，可使精子发生过程中染色质压缩错误，引起DNA脆弱性增加，导致染色质结构从组蛋白到鱼精蛋白的替代失败，产生8-OH-鸟嘌呤和8-OH-2-脱氧鸟苷（8-OHdG）。8-OHdG 是一种氧化的鸟嘌呤加合物，其水平升高与DNA 片段化和断链显著相关。王晓兰等［20］研究发现，精液中ROS和8-OHdG水平与精子运动能力呈负相关，表明精子DNA氧化损伤与精子活力低下有关。目前已知，Sirtuins 蛋白家族中的沉默信息调节因子SIRT1 和SIRT3参与肿瘤遗传信息传递、细胞衰老和OS。NASIRI等［21］通过研究弱精子症和正常精子男性精液中SIRT1、SIRT3 与抗氧化剂、OS 标志物和DNA 片段化的相关性，发现弱精子组过氧化氢酶、SOD活性和总抗氧化能力水平低于正常精子组，DNA 断裂指数和丙二醛水平高于正常精子组，弱精子症组精浆SIRT1、SIRT3 蛋白水平低于正常精子组。这表明SIRT1、SIRT3 蛋白水平与精液中的OS 程度和DNA断裂水平呈负相关。低水平的SIRT1、SIRT3可能引起OS、DNA片段化和脂质过氧化增强，最终导致精子不活跃和不成熟（弱精子症）［22］。

在精子mtDNA 数目方面，VENKATESH 等［23］研究发现，在无精子症、少弱精子症、精子无力症和精子数正常性不育的男性精液样本中均存在mtDNA损伤和数目减少。mtDNA 因缺失DNA 结合蛋白和组蛋白保护以及自身缺乏修复功能，较nDNA 更易受到OS 损伤。mtDNA 损伤会导致部分结构和（或）功能异常的蛋白被编码产生，进一步促进ROS，形成恶性循环。

DNA 具有双螺旋结构，DNA 断裂有单链（ss-）和双链（ds-）两种形式。DNA 修复只能在精子发生的特定阶段进行，附睾细胞核凝聚期间，修复机制不再激活。ss-DNA 断裂修复的下一个机会是人卵母细胞，这是胚胎发育的关键一步，但修复DNA 片段化的能力将随孕妇年龄增加而下降。ds-DNA 断裂会导致基因组不稳定以及在没有修复的情况下发生细胞凋亡［24］。据报道，未修复的DNA 片段化超过临界阈值会对胚胎发育和妊娠结局有不利影响，称为“父系效应”，含有DNA 片段化的精子在受精后会对囊胚形成、植入和妊娠结局产生负面影响。此外，有学者［25］发现，OS 对卵裂期胚胎发育有不利影响，称为“早期父系效应”。同时，ZHAO 等［26］通过Meta 分析研究DNA 片段化和辅助生殖技术结局之间的关系，结果表明，DNA 片段化与妊娠结局呈负相关，与流产的发生呈正相关。SMITH 等［27］研究还发现，ROS通过脂质过氧化作用，不仅可引起精子膜流动性发生障碍，还可通过影响精子DNA 功能，使SOD 基因表达减少，减弱机体的抗氧化能力，使过量的ROS不能被有效清除。

3.3 生精细胞和精子细胞凋亡 生精细胞和精子细胞的适度凋亡对于控制精子浓度和保障精子质量至关重要，但过度凋亡则严重损害男性生殖健康。以往研究表明，高原低压低氧环境诱发的OS能显著增加生精细胞和精子细胞凋亡，其机制是细胞通过多条死亡信号通路和调控途径进行凋亡，被称为DNA片段化引起的生理性程序性细胞死亡。

目前认为，有三条通路参与生精细胞和精子细胞凋亡。第一条是线粒体通路，也是体内存在最广泛的凋亡通路。研究表明，ROS诱导的ds-DNA断裂可导致细胞凋亡，其机制为ROS破坏线粒体膜，使线粒体膜释放细胞色素C，激活凋亡相关的Caspase 和膜联蛋白Ⅴ与磷脂酰丝氨酸结合，产生相应的核酸内切酶损伤精子nDNA，发生DNA 片段化，继而出现细胞凋亡。因此，精浆中细胞色素C水平过高可能表明过多的ROS对线粒体造成了严重的损伤。LU等［28］的实验表明，线粒体膜电位下降与增加的ROS 直接或间接损伤线粒体膜有关。第二条通路是死亡受体通路。FasL/Fas 死亡受体通路已被证实是OS 损伤导致生精细胞凋亡的途径之一［29］。当外界有害因素（如缺氧、辐射等）刺激睾丸组织产生大量ROS，ROS作为凋亡启动剂，引发Fas 与FasL 结合，活化Caspase，进入连续反应阶段，最终导致细胞凋亡。最近，YIN 等［30］研究显示，HIF-1α 基因敲除可减少缺氧诱导的小鼠精母细胞衍生细胞系凋亡，提示HIF-1α 介导的死亡受体通路和线粒体通路可能都参与了缺氧导致的细胞凋亡。学者们还发现，自噬和凋亡在广泛的串扰中相互关联，缺氧通过线粒体通路和死亡受体通路诱导细胞凋亡，并以时间依赖性方式抑制细胞自噬。研究表明，缺氧抑制自噬，自噬通过促进Caspase-8 的时间依赖性激活，进一步增强缺氧诱导的小鼠精母细胞凋亡，提示凋亡抑制和自噬激活联合应用可能是治疗缺氧性男性不育的一种策略［31］。同时，YIN 等［32］还发现，生精细胞凋亡和胞质特化破坏可能是缺氧性男性不育的关键生物学事件，在生理和（或）病理条件下（如饥饿、缺氧等），自噬在生精细胞或支持细胞中被激活，通过降解细胞骨架组织的负调节因子PDZLIM 结构域1 来抑制生精细胞凋亡、稳定ES的完整性，从而维持生精细胞存活。第三条通路是内质网通路。有学者发现，由内质网功能失常引起的不以细胞膜或线粒体为靶点的凋亡信号触发即内质网通路，也在细胞凋亡过程中发挥一定作用［33］。OS 会导致内质网功能失调，腔内出现大量未折叠和错误折叠蛋白堆积及钙泵功能紊乱，该状态被称为内质网应激（ERS）。崔艳华等［34］研究认为，持续的ERS 会引起睾丸生殖细胞凋亡，ERS 引起的细胞凋亡与Caspase 家族有关。ERS 诱导胞质中的Caspase-7 激活位于内质网膜的Caspase-12，后者可进一步激活Caspase-3，引起细胞凋亡。

高原地区具有独特的地势地貌和典型的气候特点，机体在其低压、低氧的环境因素刺激下，通过功能状态的改变，产生不同的效应来适应环境［35］，但同时也会对人体健康产生一些不利影响，如高原低压低氧环境诱发OS 对男性生殖系统的损害。高原环境对男性生殖系统的影响在生殖内分泌、生殖腺组织细胞结构、生殖系统组织生化代谢以及精液层面有不同的表现。随着对细胞、基因、分子层面的研究进一步深入，高原环境因素致男性生殖系统OS损伤的分子机制将被进一步解释，与之对应的预防和诊治措施也会进一步完善。