恶性肿瘤嗜神经浸润的体内外模型研究进展

骆惊涛

天津医科大学肿瘤医院颌面耳鼻喉肿瘤科国家肿瘤临床医学研究中心天津市肿瘤防治重点实验室天津医科大学肿瘤医院天津市恶性肿瘤临床医学研究中心，天津 300000

恶性肿瘤嗜神经浸润（PNI）指肿瘤细胞侵及神经外膜、神经周膜或神经内膜并出现局部侵袭和沿其延伸方向转移的现象，肿瘤细胞存在于任何3 层神经膜内或包绕神经外膜1/3 周长以上均可视为PNI［1］。PNI 常见于胰腺癌、头颈部癌、前列腺癌、胃癌、结肠癌等，可以导致瘫痪、疼痛，并且与癌症复发率增加和患者生存率降低有关，是导致预后不良的重要因素［2］。PNI 可在没有淋巴或血管侵犯的情况下发生，并被认为是恶性肿瘤转移的初始步骤［3］。针对恶性肿瘤的PNI的治疗可以防止肿瘤向脊髓的局部扩展，保护神经功能，减少神经侵犯引起的疼痛，最终延长患者生存率［4］。近年研究发现，PNI 中存在多种分子和途径，可通过神经生长因子等因子的驱动来影响恶性肿瘤的发生发展。然而由于缺乏一致的、可重复性的研究方法，很难对PNI相关通路的机制进行体外及体内研究，建立合理的嗜神经浸润模型对PNI 相关机制的研究至关重要。基于此，本研究就PNI 的体内、体外模型作一综述，以期为PNI提供更加精确合理的研究方法。

1 PNI的体外模型

1.1 肿瘤细胞与背根神经节（DRG）体外共培养模型 DRG 是一种细胞体，参与糖尿病神经病变的发生发展，DRG 感觉神经元的胞体是研究轴突再生的模型之一［5-6］。HUYETT 等［7］建立了头颈部鳞癌细胞Fadu与小鼠DRG 共培养模型，该模型对头颈部鳞癌细胞的培养方法、小鼠DRG 的解剖、培养基的制备、如何将DRG 插入到半固态基质液滴、如何放置头颈部鳞癌细胞作了详细介绍。该模型最重要的步骤是精确解剖和提取DRG，脊柱的适当横断和中线—纵向分成两个半棘是获得大量DRG 的关键。在解剖单个DRG 时，切勿直接处理神经节，而应用显微镜钳夹住周围的筋膜。DRG 的挤压损伤是轴突生长失败的主要原因，过度处理DRG 可导致轴突难以生长。该模型的优点是具有非常高的成功率和可重复性，总实验时间也相对较短，使用活细胞成像可以在时间推移视频形式下观察轴突生长过程和头颈部鳞癌细胞侵袭。该模型在细胞接种前1 h 加入荧光细胞染色剂，可以自由穿过细胞膜，而在与细胞内的巯基反应后，染色仍留在细胞内，并传递到子细胞。荧光染色可促进检测中的可视化，因为荧光能够存在2～3 d，与头颈部鳞癌细胞Fadu 发生神经浸润的时间框架相同。同时，该模型在荧光染色时还允许使用多种不同的颜色，并且不需要创建荧光蛋白转染的细胞系，荧光染色细胞的加入在肿瘤细胞和背景物质之间产生了非常明显的分化，更加易于观察。但该模型也存在技术局限性：①由于该模型采用非常细小的神经突起替代大量的神经浸润，因此目前尚不能明确轴突相对于神经元在活体中的作用；②研究中缺乏体外肿瘤环境中固有的外源性因子；③由于成纤维细胞外流和基质完整性的丧失，可以研究PNI的时间被限制在48 h内。这些局限性的存在可能导致某些具有神经侵袭功能但分裂或侵袭缓慢的细胞系被遗漏，并被推定为不具备PNI 的能力。该模型还介绍了一种量化PNI 结果的评分系统，将检测图像分为具有垂直线和水平线的四个象限，如果任一象限至少具有一串肿瘤细胞由基质边缘向GRG延伸而发生PNI则计1分，若发生PNI的肿瘤细胞从基质边缘延伸到DRG 的路径超过50%则计2分，通过这种方式，可以分配0～8 分的分数。该分析方法主要优点为能够快速分析出许多PNI细胞的分数，缺点为不能充分表达PNI的程度（一个象限有1 个神经突起，侵犯到DRG 的距离为100%，得到的分数为2 分，与有10 个类似侵袭轴突的象限所得到的分数相同）。该模型常用于体外研究神经元与肿瘤细胞间旁分泌的相互作用，其可根据测试假设对微环境进行修改，如在培养皿中加入第三种细胞培养物（例如非癌细胞）使研究人员能够比较不同细胞的嗜神经迁移能力；此外，研究人员还可以应用不同的条件（温度、湿度、可溶性因素等）并检测其对细胞侵袭能力的影响。但由于该模型使用的是小鼠DRG，小鼠细胞可能与人类细胞不相容，所以当使用人类肿瘤细胞时，并不是总会表现出鼠—人蛋白—蛋白的相互作用。因此，当计划对两个不同的物种使用该模型时，应测试所检查蛋白质的同源性，若同源性高，则该模型可适用于评估蛋白质—蛋白质的相互作用。

1.2 肿瘤细胞与神经外植体共培养模型 ABIATARI 等［8］在无菌条件下解剖大鼠迷走神经颈部约5 mm 的部分，并距离室底0.7 mm 放置在专门设计的神经侵犯室中；将培养箱放置在含有标准培养基的组织培养板上，将胰腺导管腺癌细胞PDAC 胰蛋白酶化，再悬浮于培养基中，将细胞悬液灌入培养箱，以此方法获得三种神经浸润侵袭性胰腺癌细胞；将神经从侵入室取出，10% 甲醛固定并用石蜡包埋；免疫组织化学法检测神经中的肿瘤细胞侵入情况。需要注意的是，为了避免该模型出现“假克隆”，神经室中的培养基水平要保持高于板中的培养基水平，并在整个实验过程中进行控制，以排除培养基/细胞悬浮液从神经室中泄漏的情况。

1.3 肿瘤细胞与施万细胞共培养模型 施万细胞是周围神经系统中主要的神经胶质细胞，其可能是促进肿瘤生长和疼痛的炎症介质的主要来源［9］。研究显示，肿瘤细胞可利用施万细胞的典型功能促进PNI［10］。SU 等［11］建立了肿瘤细胞与人施万细胞之间的体外共培养系统。将5×105个人施万细胞接种在六孔板的底部，同时将5×105个肿瘤细胞（人转移胰腺腺癌细胞AsPC-1、人胰腺癌细胞MIA PaCa-2）加入孔径为0.4 μm 的上部Transwell 嵌件。将共培养系统与完整培养基分别保持24 h 或48 h 用于RNA提取或共培养条件培养基收集。该模型模拟了肿瘤细胞与施万细胞之间的相互作用，使研究者能够观察其生物学行为的变化，重现体内肿瘤细胞神经转移的过程。但体内微环境很难复制，该系统未能模拟体内两种细胞相互作用时的酸碱度、CO2浓度、营养等情况，有待于后期进一步改善。

1.4 肿瘤细胞与PC-12 神经元细胞/50B11 神经元细胞共培养模型 PC-12 是经典的神经元模型，而50B11 是永生的DRG 感觉神经元细胞系，两者均适用于模拟 PNI 的临床观察［12］。YIN 等［13］在 Matrigel中培养分化的PC-12/50B11 细胞，然后将荧光标记的肿瘤细胞添加到培养基中，使肿瘤细胞广泛分散，以增加与大量单个神经突起相互作用的机会。同时，在空白基质凝胶周围种植荧光肿瘤细胞，在相同的实验条件下，独立于与神经细胞的外部相互作用。该模型可评估自主肿瘤细胞侵袭，通过定量测定局限于肿瘤—神经细胞的含神经突基质凝胶中的荧光癌细胞来确定癌细胞的神经侵袭能力。

2 PNI的体内模型

2.1 小鼠原位胰腺肿瘤的神经侵袭和转移模型JURCAK 等［3］将小鼠剖腹，将悬浮于20 mL 磷酸盐缓冲盐水中的胰腺导管腺癌基因工程小鼠肿瘤细胞注入小鼠胰腺，注射后第10 天对胰腺肿瘤区进行HE染色、苏木精和神经特异性标记物TUJ1免疫组化染色，观察并分析神经密度及神经数量。

2.2 将同基因胰腺癌细胞注射到坐骨神经中进行神经侵袭的活体小鼠模型 ZHANG 等［14］将同基因胰腺癌细胞注射到小鼠坐骨神经中建立了PNI的体内模型，该模型使用异氟醚麻醉4周大小的裸鼠，暴露麻醉小鼠的坐骨神经并注射胰腺癌细胞，使胰腺癌细胞从注射点向脊髓近端侵入神经，然后评估小鼠肢体功能和坐骨神经功能指数以评估PNI的严重程度。在该模型的制备过程中需要仔细处理3个关键步骤：①肿瘤细胞注射：注射肿瘤细胞时要非常小心，刺穿神经的后壁会导致肿瘤细胞损失。一旦针头就位，注射应缓慢而稳定地进行5 s 以上，以防止液压力将肿瘤细胞从注射点向前推进得太远。注射后应在神经上留置针3 s，可减少回流和肿瘤细胞渗漏。②提取侵入的神经：在坐骨神经提取过程中，由于被侵犯的坐骨神经非常脆弱，解剖时需非常轻柔，以防止被侵犯的神经断裂。③采集神经的处理：神经的整个长度必须完全平放在模具上。该模型同时也存在一定的局限性：①虽然在手术过程中对神经的处理尽量轻柔，但仍不可避免神经拉伸和挤压可能会对神经造成损害；②很难控制进入神经细胞的确切数量；③该模型仅限于对已经侵入神经的肿瘤细胞进行研究，而不能够研究神经与位于原发肿瘤中的肿瘤细胞相互作用，缺乏评估PNI 早期阶段的能力；④与胃肠道神经相比，使用坐骨神经的主要缺点是坐骨神经不是胰腺癌的转移部位，神经纤维的组成和性质的不同可能影响神经的侵袭，但是胰腺神经很难获得并且体积非常小，不允许这样的研究。该模型具有较强的通用性，可以应用于各种PNI 研究，可以使用具有不同基因修饰或不同类型肿瘤细胞的小鼠来研究PNI 的细胞和分子机制。HUANG 等［15］在此模型的基础上利用氧化铁纳米颗粒和磁共振成像建立了一种敏感、无创的神经侵犯监测方法，该方法在一定程度上克服了现有的体内PNI 评估方法的局限性，具有一定的应用价值。此外，通过对研究小鼠进行治疗，此模型可以研究治疗药物对神经侵袭的影响。

2.3 鸡胚绒毛膜尿囊膜（CAM）体内模型 SCHMITD等［16］使用CAM 在体模型评价头颈部肿瘤神经周围浸润。该模型将大鼠DRG 和人头颈部鳞状癌细胞移植到鸡胚绒毛上皮，用于评估肿瘤细胞在体内侵袭神经组织的能力。该模型可以通过荧光标记DRG 和肿瘤细胞，更加便于观察，采用Image J6 图像分析仪测量肿瘤细胞与DRG 的距离和肿瘤面积，并用t检验评估各组之间的差异；使用石蜡包埋的CAM 组织切片，对其进行免疫组织化学染色评估结缔组织内的侵袭性。该模型的优点是可以评估PNI 以及肿瘤生长、转移和血管生成，比坐骨神经注射肿瘤细胞的小鼠模型更加经济。而该模型存在的局限性为：①在将肿瘤细胞移植到DRG 附近时的距离不好掌握，肿瘤细胞与DRG 之间的距离过近或过远可能会损害肿瘤细胞和神经之间的分子相互作用。②如果胚胎年龄大于该方案中的规定年龄，胚胎运动可能会取代肿瘤细胞，因此一定要使用与受精后第10 天一致的鸡胚进行细胞移植。③由于鸡胚免疫系统在18 d 之前还没有完全发育，因此，该模型不适用于评估免疫细胞在肿瘤发展中的作用。④可用于鸡胚的试剂如抗体、细胞因子和引物比较有限。目前在体内实验水平上，小鼠异种移植模型是用于评估药物行为的最常见模型，由于啮齿动物临床前模型既昂贵又耗时，并引起伦理关注，使得鸡绒毛尿囊膜试验成为常用动物模型的有效替代方法，该模型也广泛应用于血管生成作用的研究［17-18］。

综上所述，肿瘤细胞与DRG、神经外植体、施万细胞、PC-12 神经元细胞/50B11 神经元细胞共培养模型等PNI体外模型以及小鼠原位胰腺肿瘤的神经侵袭和转移模型、将同基因胰腺癌细胞注射到坐骨神经中进行神经侵袭的活体小鼠模型、CAM 体内模型等PNI 体内模型已被应用于肿瘤学的研究中，在肿瘤转移、侵袭及药物治疗等研究领域发挥作用。每个PNI 研究模型都有其不同的优势和劣势，建立合理的实验模型对进一步研究恶性肿瘤PNI的机制及治疗方案是十分必要的。