DNA分子标记技术在菊花种质资源中的应用研究

高雅迪，张振豪，王一帆，刘慧婕，沈晨佳，王慧中，冯尚国

(杭州师范大学生命与环境科学学院浙江省药用植物种质改良和质量监控重点实验室，浙江 杭州 311121)

菊花(ChrysanthemummorifoliumRamat.)为菊科(Compositae)菊属(ChrysanthemumL.)多年生花卉，在花卉界被誉为世界两大花卉育种奇观之一[1].菊花是我国的传统名花，具有极高的经济和观赏价值，其多姿多彩的形态和丰富的文化内涵深受我国人民的喜爱，至今有不少地方仍保留着在秋季举办菊展的传统.我国菊花栽培具有悠久的历史，分布广泛，品种多样，清朝《广群芳谱》所记载的菊花品种就有300～400种.南京农业大学收集保存了3 000多个菊花品种的5 000多份种质资源，成为中国菊花种质资源保存中心.医学研究表明，菊花含有挥发油、菊甙、氨基酸、黄酮类、多种维生素和微量元素，对大肠杆菌、福氏痢疾杆菌、金黄色葡萄球菌有较强的抑制作用，具有止痢、降压、降脂、消炎、明目、强身的作用[2-4].另外，菊花还具有散风清热、平肝明目、清热解毒的功效，常用于治疗风热感冒、头痛眩晕、目赤肿痛、眼目昏花和疮痈肿毒[5].

菊花品种繁多，花的形态、颜色差异较大，菊花品种的分类鉴定成为重要的科学问题.国内外有着各种各样的菊花品种分类体系.早在宋代，人们便开始以颜色来区分菊花品种，其次是花形和花期.汤忠皓[6]根据花径大小、花枝习性将菊花分成两大区，然后依据舌状花与管状花数量之比分成舌状花系与盘状花系，最后再依据瓣形及瓣化程度分成类和型.美国、日本和英国等国家对菊花品种分类也有各自不同的分类体系.总体上，目前菊花品种的分类比较混乱，同名异物、同物异名现象严重.同时，菊花复杂的遗传背景和混乱的亲缘关系也给菊花育种工作带来了非常大的阻碍.另外，由于长期的相互引种栽培，地区间菊花类型混杂.大量研究表明菊花种质资源在形态特征、内在质量和产量等方面均有较大差异.因此，对菊花种质资源开展分子评价及遗传资源保护研究是十分急迫和必要的.

与传统的形态学标记、细胞标记和生化标记技术相比，DNA分子标记不受外界环境、发育阶段以及组织器官差异的影响，可以对生物个体不同发育时期的各个器官、组织甚至细胞等进行检测.DNA分子标记稳定性强、数量多、遍布于整个植物基因组，可提供的遗传信息量大.因此，DNA分子标记已成为研究学者进行植物遗传多样性评价、系统进化重建、种质资源鉴定及遗传图谱构建等研究的重要技术手段[7].本文对近年来DNA分子标记技术在菊花遗传多样性评价、系统发育分析、种质鉴定、遗传图谱构建及QTL定位和表型性状关联分析等方面的研究进展进行综述，以期为菊花种质资源的精确鉴别和合理开发利用提供有效的分子技术依据.

1 遗传多样性研究

遗传多样性一般是指植物种内个体之间或群体内不同个体的遗传变异之和，是物种多样性的重要来源.对遗传多样性的研究有助于人们更好地认识植物多样性的起源和进化，为植物的分类进化、遗传育种、资源保护和遗传改良奠定基础.近年来，开展了较多的基于DNA分子标记的菊花植物遗传多样性的研究.徐文斌等[8]运用RAPD 标记对22个基因型药用菊花的遗传多样性进行了检测，结果发现药用菊花种质资源在分子水平上存在较大差异，药用菊花栽培类型间的差异与环境因素有关，但更大程度上由其遗传因素决定.Kumar等[9]利用RAPD标记分析38个菊花品种的遗传多样性和亲缘关系，发现菊花品种间存在丰富的多样性.Lema-Ruminska等[10]利用RAPD标记对2个菊花品种‘Lady Salmon’和‘Lady Vitroflora’及其15个体细胞胚衍生株系的遗传多样性进行了研究，结果显示所有品种及其品系分为两个主聚类和两个亚聚类.韩洁[11]利用AFLP分子标记技术，对45个菊花品种进行遗传多样性和亲缘关系分析，研究表明供试品种资源DNA水平酶切位点的分布存在广泛的变异，并将45份菊花资源分成6个类群.Roein等[12]利用AFLP分子标记及形态性状标记对30个伊朗菊花品种进行遗传结构研究，结果显示品种之间存在丰富的多态性，供试菊花品种被聚类为4组.Feng等分别基于SSR标记[13]和SCoT标记[14]对32个药用菊花品种进行了遗传多样性评价，研究表明SSR和SCoT标记均具有较高的可重复性和信息性，可用于评价药用菊花品种间的遗传多样性和亲缘关系.Fan等[15]开发获得了361对多态性SSR标记引物，利用SSR标记对59个菊花样本进行了基因分型和分类研究，聚类分析表明供试材料可分为6个系统发育类群.Hodaei等[16]利用形态性状标记和SRAP标记对30个伊朗菊花品种进行研究，研究表明SRAP标记和形态特征标记在分析菊花遗传多样性方面具有很大的潜力，并可以用于选择杂交育种计划中的理想亲本，为观赏用途开发优良品种.吴洋洋等[17]基于SRAP分子标记对6个切花菊品种及其38个F1代单株的遗传关系进行研究，研究表明SRAP分子标记可有效用于鉴定菊花不同杂交组合后代.Samarina等[18]利用36个SCoT标记、10个ISSR标记和5个微卫星标记对主要来自俄罗斯的95份菊花核心种质的遗传多样性进行研究，为菊花重要性状标记的选择、菊花性状定向育种和种质鉴定提供了新的依据.

2 系统发育研究

DNA分子标记技术的发展推动了植物系统发育研究领域的不断进步.戴思兰等[19]首次使用22个RAPD标记引物对7种野生菊花、14种栽培菊花和5个种间杂交种进行分析，提出栽培菊花主要起源于毛华菊、野菊和菊花脑.李辛雷等[20]基于RAPD标记研究菊属野生种、栽培药用菊花及种间杂种的亲缘关系，探究了栽培菊花的起源演化，为菊属植物幼胚拯救及遗传育种工作提供了一定的理论指导.吕琳等[21]利用ISSR分子标记对不同地区来源的19份药用菊花种源、4份野菊种源、1份菊花脑种源和1份杂交菊花进行遗传关系分析，结果显示25份种源可分成两大组，野菊、菊花脑和杂交菊花聚为一类，19份药用菊花种源聚为一类.Luo等[22]利用SSR标记对88个菊花品种及其近缘属物种进行遗传关系及分类研究，将野生品种和大花品种划分为2个聚类，并将大花品种按花瓣类型划分为5个组，表明菊花花瓣类型可以作为分类标准.Shen等[23]利用7个低拷贝核位点和rDNA ITS序列，以菊花类群为重点，重建了青蒿亚族的系统发育过程，研究表明菊花类群首先起源于中亚，紧接着菊花向东部迁移，至阿加尼亚地区开始原地多样化进化，研究结果同时显示菊花族3个谱系的地理结构与亚洲内部的生态位分化和环境异质性有关.

3 种质资源鉴定

有研究采用RAPD技术对15个菊花品种进行鉴定，结果显示RAPD标记可以区分供试菊花品种，品种间的相似程度较低[24].Barakat等[25]利用RAPD标记对菊花突变体及其亲本进行鉴定，研究表明14个菊花基因型的遗传相似度为0.43～0.95，菊花品种及其13个体细胞无性系分为5个类群.Mekapogu等[26]利用23个SSR标记对11个标准型菊花品种进行鉴定区分，结果仅用ChSSR_16标记就可以对11个标准型品种进行鉴别.Shirao等[27]开发获得了4个菊花新品种的特异性DNA标记(RAPD和AP-PCR标记)，为菊花新品种及其他园艺和农业作物无性系品种的鉴定提供了重要的技术积累.裴莉昕等[28]基于叶绿体基因trnL-trnF序列对菊花和野菊花药材开展DNA分子鉴别，研究表明菊花特异性标记可以将菊花和野菊花区分，为菊花和野菊花药材快速准确鉴别奠定了基础.Asha等[29]利用ISSR和SSR标记技术对30个菊花品种进行基因型鉴定和遗传亲缘关系评价，研究显示30个菊花基因型之间存在显著差异，ISSR和SSR分子标记均可用于菊花的性状鉴别研究.Zhang等[30]利用20个SSR标记建立了480个中国传统菊花品种的DNA指纹图谱和分子特征，初步鉴定了480个中国传统菊花品种，并选择5个SSR标记位点作为核心位点，建立了每个菊花品种的独特指纹图谱和分子身份.Nasri等[31]利用ISSR和IRAP标记成功对菊花甲基磺酸乙酯(EMS)诱变突变体及其母株进行了鉴别分类.Chatterjee等[32]基于RAPD标记对10个菊花原种和11个突变体的分子系统学和遗传差异进行f分析，研究表明利用RAPD技术可以在分子水平上鉴定不同花色的菊花突变体.秦贺兰等[33]开展小菊花色芽变品系的SRAP鉴定研究，共获得8条可能与花色芽变基因有关的特异条带，这些特异条带可以在植物生长早期用于鉴别菊花芽变品种与对照.

4 遗传连锁图谱构建及QTL定位

遗传图谱是已知性状的基因或特定DNA分子标记在染色体上的排列顺序和间距的线性排列图.遗传连锁图谱构建是进行分子辅助育种、目的基因定位和数量性状研究的基础，也是植物基因组学研究的关键环节，为植物资源的保存、利用及种质遗传改良提供了可靠的科学依据.Zhang等[34]采用RAPD、ISSR和AFLP标记，采用双拟测交作图策略，对菊花品种‘雨花落英’ב奥运含笑’杂交的142个F1子代进行基因分型，构建了菊花的遗传连锁图谱，为菊花的进一步数量性状QTL定位和标记辅助育种奠定了基础.van Geest等[35]基于SNP标记，构建了菊花第一张完整的六倍体遗传连锁图谱，研究了亲本单倍型在后代中的遗传和多等位基因QTL的检测.Song等[36]采用SLAF-seq技术构建了菊花花型性状高密度基因连锁图谱，平均图谱距离为0.76 cM，共检测到3个控制花冠筒融合度(CTMD)的主要QTL和4个支持舌状小花相对数(RNRF)的主要QTL.Fu等[37]利用SSR标记技术对80个菊花品种开展了对蚜虫抗性的遗传变异及关联定位研究，分析了夏秋两季菊花抗蚜性的遗传变异特征，利用关联作图法共鉴定出11个与蚜虫抗性相关的标记，单个解释的表型变异范围为11%～57%，其中SSR184-1和E1M5-1被鉴定为抗蚜的有利等位基因，7个具有这两个有利等位基因的品种被鉴定为潜在的供体亲本，可用于今后的抗蚜育种.Su等[38]以162个菊花F1系群体为材料，利用SRAP和SSR标记构建遗传图谱，对菊花的4个耐涝性性状的QTL进行了动态和上位性分析，研究发现控制菊花耐涝性性状的QTL是环境依赖的，在不同的时间有选择性表达，表明在菊花耐涝性性状的遗传上存在加性和上位性效应.在此基础上，Su等[39 ]又基于SNP分子标记对88个菊花品种进行了全基因组关联(GWAS)分析，进一步解析了菊花耐涝性的遗传基础.

5 表型性状关联分析

研究植物表型性状与DNA分子标记之间的关联性，可以从分子水平揭示植物表型性状的遗传变异机制，为植物分子育种和性状遗传改良奠定重要基础.张飞等[40]以菊花‘雨花落英’和‘奥运含笑’及其142株F1群体为材料，利用RAPD和ISSR标记技术开展了与F1群体营养生长期6个观赏性状的关联研究，研究表明，与株高、株幅、株高/株幅、节间长度、叶长和叶宽相关联的遗传标记有59个，这些标记的累积贡献率均在30%以上.另外，张飞等[41]还利用SRAP标记开展了菊花F1代花器性状关联分析研究，为进一步研究菊花花器性状奠定了遗传基础.Zhang等[42]基于SRAP基因分型的标记-性状关联分析研究菊花初花期和开花持续时间这两个开花性状的遗传，研究表明，与表型显著相关的标记有10个(初始开花时间)和12个(开花期)，分别解释了46%和54%的变异.李仁伟等[43]运用19对SRAP标记引物对58个大菊品种进行研究，利用获得的分子标记与18个重要表型性状进行关联分析，研究发现，与花部性状(花梗粗度、花瓣宽度、筒状小花数量)关联的位点有5个，与茎部(茎粗度)关联的位点有1个，与叶部性状(叶厚度)关联的位点1个，每个位点对表型变异的解释率在0.073 8～0.479 1.杨旭旭[44]测量59个大菊品种的表型性状，并结合SCoT分子标记进行关联分析，发现有18个位点与花部性状(舌状花的长度、宽度、长/宽)相关联，9个位点与叶部性状(叶柄长度、叶片长度、叶片长/宽、托叶大小)相关联.袁王俊等[45]利用16对SSR标记引物和10条SCoT标记引物对99个菊花品种进行基因组变异分析，并对10个表型性状进行关联分析，发现有8个SSR位点与7个表型性状(花序直径、花序高度、舌花宽度、叶柄长度、叶片长度、托叶大小及叶一级刻度)相关联，3个SCoT位点与花序直径相关联.李沛曈等[46]利用SSR标记开展了异色菊×菊花脑种间杂交F1代遗传多态性分析、耐旱性鉴定及关联分析，为菊花耐旱性遗传改良研究奠定了基础.叶松[47]对99个不同菊花品种进行表型性状检测，并利用SSR和SCoT标记进行了相关性状的关联分析，研究发现有3个SSR位点分别与4个表型性状(花序高度、舌状花宽度、叶柄长度和叶片长度)相关联，另外有21个SCoT位点与菊花的7个表型性状相关联.Chong等[48]基于SNP标记对199菊花品种的遗传多样性、系统进化和性状相关候选基因进行了研究，为一些关键观赏性状的进化关系、群体结构和遗传基础提供了新的见解.除此之外，Chong 等[49]还基于SNP标记及表型数据，对107种菊花开展了全基因组关联研究，分析了3个花序相关性状的遗传控制情况，共鉴定出81个与花序性状相关的SNPs，确定了3个目标性状的15个高度有效的SNP位点.

6 展望

DNA分子标记技术已成为菊花遗传育种研究中的重要技术手段，存在如RAPD、ISSR等一些早期传统分子标记的稳定性和可重复性不够理想、标记的数量和可提供的遗传信息较有限等问题.但和传统的形态标记、细胞标记和生化标记比较，分子标记技术依然有着独特的优势.伴随着生物学技术的发展，DNA分子标记技术的检测准确性、经济成本、时间周期都在不断地更新和完善，相信在不久的将来，DNA分子标记技术在菊花种质资源遗传多样性、分子遗传育种、遗传图谱及QTL定位等方面可得到更加深入的应用.