大麦籽粒淀粉含量的QTL定位分析

雍杨莹，于浪柳，李春燕，张蓝天，董梦圆，薛大伟，方云霞，张晓勤

(杭州师范大学生命与环境科学学院，浙江 杭州 311121)

大麦(HordeumvulgareL.)是种植面积仅次于水稻、玉米和小麦的重要禾谷类作物，具有饲用、酿造、食用等多种用途[1].淀粉是大麦籽粒的主要成分之一，根据淀粉构型的不同，可分为直链淀粉和支链淀粉.籽粒直链淀粉和支链淀粉的比例以及总淀粉含量是决定大麦品质及特性的重要因素之一，直接影响大麦的食用、饲用和工业加工价值[2].总淀粉含量的增加提高了大麦作为饲料的经济价值.高直链淀粉的品种利于提高大麦浸出率，啤用品质更好[3].低直链淀粉高支链淀粉的糯性大麦，以更优的口感越来越多地出现在食品加工业中；经过化学修饰的支链淀粉透明性和稳定性得到提高，因此糯性大麦在医药、纺织、航空及钻探等工业领域被广泛应用[4].

目前，关于禾谷类作物淀粉含量遗传分析研究主要集中在小麦[5]、水稻[6]和玉米[7]上，而有关大麦籽粒淀粉含量性状的遗传研究相对较迟，尚不够深入，控制大麦淀粉含量相关的QTL报道相对较少.Borém等[8]发现控制大麦淀粉粒大小、粒径之比及淀粉总含量的QTL位于染色体2H、4H和5H上；Islamovic等[9]用连续栽培3年的RIL群体材料进行QTL定位分析，将控制直链淀粉含量的QTL位点定位到1H、5H和7H上；朱德馨[10]用188份DH系群体为材料，对大麦籽粒总淀粉含量进行QTL连锁定位分析，共检测到7个QTLs，分别位于1H和4H上；范祥云等[11-12]利用DH群体构建的遗传图谱进行QTL分析，分别在3H、4H和7H上鉴定到3个与直链淀粉相关的QTL，而在染色体3、4、5和7H上鉴定到4个与支链淀粉含量相关的QTL.

本研究以大麦品种Golden Promise (GP)和H602杂交构建的重组自交系(recombinant inbred lines, RILs)为研究材料，在2018—2019和2019—2020两个生长季，利用碘比色法测定自交系群体134个株系及亲本材料的直链淀粉和支链淀粉质量分数，并进行控制淀粉含量性状的QTL初步定位，以期获取大麦籽粒淀粉相关的遗传规律，为高淀粉含量大麦品种选育和优质性状基因的克隆提供理论依据.

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试材料为优质啤用大麦品种GP和野生大麦H602杂交构建的134个重组自交系.于2018—2019和2019—2020两个生长季，分别在杭州师范大学实验地种植亲本及134个RILs.收获当年大麦种子作为试验材料，取待测大麦籽粒，烘干至恒重，用打粉机打成粉末备用.

1.2 直链淀粉和支链淀粉含量测定

采用直链、支链淀粉测定试剂盒(碘比色法)(苏州格锐思生物科技有限公司)测定籽粒中的直链、支链淀粉质量分数，操作步骤根据试剂盒说明书进行.直链淀粉与酸性提取液形成的碘-淀粉络合物在620 nm下有吸收峰，可计算出样品直链淀粉质量分数；支链淀粉与碘形成的络合物通过双波长(540、740 nm)比色法测定，得到支链淀粉的质量分数.

利用试剂盒中提供的标样，绘制标准曲线.待测样品在相同条件下测定其吸光度值，借助标准曲线计算样品的淀粉质量分数.吸光度值利用分光光度计(UV-2600，SHIMADZU)测定.

1.3 QTL定位

运用Excel 2010及IBM SPSS 20.0软件对试验所得群体数据进行正态分布、性状间的相关性等分析.RILs群体的高密度遗传图谱为实验室前期通过简化基因组测序方法构建[13].基于该遗传图谱，利用qgene 4.3.10软件[14]复合区间作图法(composite interval mapping, CIM)进行QTL分析.采用排列组合1 000次的方法确定LOD阈值.QTL位点的判断阈值取LOD≥2(P=0.05).

2 结果与分析

2.1 RIL群体淀粉含量各性状的相关性分析

2018—2019生长季和2019—2020生长季，大麦亲本及RIL群体后代134个株系籽粒的直链淀粉、支链淀粉和总淀粉质量分数相关系数列于表1.总体来看，每个生长季内直链淀粉质量分数、支链淀粉质量分数与总淀粉质量分数之间均呈正相关(P<0.01)，两个生长季间的支链淀粉和总淀粉质量分数之间也呈正相关(P<0.01).

表1 RIL群体直链淀粉、支链淀粉和总淀粉质量分数的相关性分析Tab.1 Correlations between amylose, amylopectin and total starch mass fraction in RILs

2.2 直链淀粉和支链淀粉含量的遗传变异

如表2所示，不同年份间亲本和RIL群体后代的表型结果存在差异，说明环境差异对直链淀粉含量和支链淀粉含量具有一定的影响.淀粉质量分数在RIL群体中出现了超亲分离，说明该性状存在一定的遗传变异.从性状分布的偏度和峰度来看，其绝对值<1，表明RIL群体的淀粉质量分数符合正态分布，呈单峰分布曲线(图1)，具有典型的数量性状特征，表明大麦RIL群体籽粒淀粉含量的遗传受多基因控制.

表2 亲本和RIL群体后代的大麦籽粒淀粉质量分数Tab.2 Grain starch mass fraction in parents and RIL population of barley

图1 大麦籽粒淀粉质量分数在RIL群体中的频率分布Fig.1 The frequency distributions of starch mass fraction in barley

2.3 大麦籽粒淀粉含量的QTLs分析

采用CIM法，判断阈值LOD≥2.0为QTL，对两个生长季大麦RIL群体籽粒淀粉含量进行QTL定位，共检测到8个QTL(表3).其中，与直链淀粉含量相关QTL有2个，均位于染色体7H上；与支链淀粉含量相关QTL和与总淀粉含量相关QTL均有3个，位于染色体2H和7H上.如图2所示，位于染色体7H上区间距离0～2.2 cM (centimorgan，cM)处，检测到共同存在3种淀粉含量相关的QTL;位于染色体7H上区间距离24.8～26.9 cM处，检测到共同存在与支链淀粉含量和总淀粉含量相关的QTL;位于染色体2H上区间距离40.1～41.3 cM处，检测到共同存在与支链淀粉含量和总淀粉含量相关的QTL.

表3 大麦籽粒淀粉含量的QTL分析Tab.3 QTL analysis for grain starch content in barley

注：染色体上的每条黑线表示一个标记.

2.3.1 直链淀粉含量QTL分析

2018—2019生长季群体中共检测到2个与直链淀粉含量相关的微效QTL位点，命名为qAC7-1和qAC7-2，均位于染色体7H上，区间距离分别为0～2.2 cM和20.5～21.5 cM，其加性效应均为正值，表明增加直链淀粉含量的等位基因来自亲本GP，贡献率分别为8.52%和7.83%.2019—2020生长季群体中未检测到与直链淀粉含量相关的QTL.

2.3.2 支链淀粉含量QTL分析

2018—2019生长季群体中共检测到2个与支链淀粉含量相关的主效QTL位点，命名为qAPC7-1和qAPC7-2，均位于染色体7H上，区间距离分别为0～2.2 cM和24.8～26.9 cM，其加性效应均为正值，表明增加支链淀粉含量的等位基因来自母本GP，贡献率分别为15.53%和16.40%.2019—2020生长季群体中检测到与支链淀粉含量相关的主效QTL位点qAPC2-1，位于染色体2H上，区间距离为40.1～41.3 cM，其加性效应为负值-0.077，表明增加支链淀粉含量的等位基因来自父本H602，贡献率为12.71%.

2.3.3 总淀粉含量QTL分析

2018—2019生长季群体中共检测到2个与总淀粉含量相关的主效QTL位点，命名为qT7-1和qT7-2，均位于染色体7H上，区间距离分别为0～2.2 cM和24.8～26.9 cM，其加性效应均为正值，表明增加总淀粉含量的等位基因来自母本GP，贡献率分别为24.05%和24.02%.2019—2020生长季群体中检测到与总淀粉含量相关的主效QTL位点qT2-1，位于染色体2H上，区间距离为40.1～41.3 cM，其加性效应为负值-0.078，表明增加总淀粉含量的等位基因来自父本H602，贡献率为12.79%.

3 讨论

本研究两年间的大麦籽粒淀粉含量测定结果显示，两年大麦籽粒群体的直链淀粉含量和支链淀粉含量及总淀粉含量呈连续正态分布特征，表明大麦RIL群体籽粒淀粉含量具有广泛遗传变异，且主要由主效基因控制，验证了大麦淀粉含量为典型的数量性状，这与前人的研究结果相一致[15-16].

大麦籽粒淀粉含量不仅受遗传因素的调控，也易受到环境的影响，如施氮水平、种植密度、浇水量等环境因素[17].不同环境条件下，基因的表达与否以及表达量的多少也会存在一定的差异.2018—2019和2019—2020生长季检测的大麦籽粒直链淀粉含量及支链淀粉含量有差异，且2018—2019生长季检测到的QTL位点均位于染色体7H上，而2019—2020生长季检测到的QTL位点均位于染色体2H上，未出现两年相同的QTL位点，说明环境因素影响大麦籽粒淀粉含量，两年间种植收获的大麦之间存在差异.

本研究检测出的8个QTL位点中有6个位于7H上，2个位于2H上.前人有关大麦淀粉品质性状的QTL分析研究亦出现与本研究相同的染色体.范祥云等[11-12]利用SNP标记对DH群体进行QTL鉴定，通过连锁分析鉴定到多个QTL，其中7H上17.4 cM和81.8 cM处分别检测到稳定遗传的直链淀粉和支链淀粉含量相关QTL.Islamovic等[9]连续3年均在7H上鉴定到控制直链淀粉含量的QTL位点，该QTL遗传距离约为15.9 cM.这2个QTL均与我们检测到的直链淀粉含量QTLqAC7-2位置较为接近，有可能为同一QTL.

Li等[18]通过100份来自41个国家或地区的国际大麦核心选择集材料进行直链淀粉和支链淀粉的GWAS分析，分别鉴定出总淀粉、直链淀粉及支链淀粉的13、2和10个QTLs，有5个QTL同时影响总淀粉和支链淀粉含量.本研究在2018—2019生长季检测到2个与总淀粉含量相关QTL位点qT7-1和qT7-2，位于染色体7H上，贡献率分别为24.05%和24.02%，增效基因源于母本；2019—2020生长季，在2H上检测到一个与总淀粉含量相关QTL位点qT2-1，其贡献率为12.79%.同时，在主效基因qT7-1所在区间0～2.2 cM内还分别检测到调控直链淀粉和支链淀粉含量相关的QTL位点qAC7-1和qAPC7-1；主效基因qT7-2所在区间24.8～26.9 cM处检测到与支链淀粉含量相关的QTL位点qAPC7-1；主效基因qT2-1所在区间还存在与支链淀粉含量相关的QTL位点qAPC2-1.由于总淀粉质量分数为直链淀粉质量分数与支链淀粉质量分数之和，3个性状间的重叠关系可能表明大麦籽粒中淀粉物质因共同的遗传而具有相关性，初步推测与总淀粉含量相关的QTL位点与直链淀粉和支链淀粉含量相关的QTL位点为同一个位点，这几个区间可作为进一步精确定位的主要目标QTL.

本研究检测到的主效QTL较少，贡献率较小，故关于淀粉含量QTL更精细的定位有待进一步验证.找到淀粉含量更精细的位点，可以更好地揭示调控淀粉合成代谢的基因，更有针对性地提高功能大麦的淀粉含量，创制高淀粉含量功能大麦新种质.