数字PCR技术在晚期肺腺癌患者血浆ctDNA EGFR基因突变检测中的应用初探

彭韵霖，唐中，方莉

(川北医学院附属医院，1.产前诊断中心；2.检验科；3.川北医学院医学检验系，四川 南充 637000)

在精准医疗大背景下，晚期肺腺癌患者的治疗手段已经从传统的放化疗过渡到靶向治疗[1]，即针对特定靶点进行治疗。表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)是癌症的重要驱动因子，EGFR蛋白酪氨酸激酶功能与肿瘤细胞增殖、血管生成等密切相关。因此在治疗前应明确EGFR基因突变状态，再采用EGFR酪氨酸激酶抑制剂(tyrosine-kinase inhibitor，TKI)进行治疗。既往研究结果显示，应用TKI可改善患者的无进展生存时间(progression-free survival，PFS)，但部分患者在EGFR-TKI治疗10个月后产生耐药性。研究[2-3]显示，耐药患者中，约50%存在EGFR基因20号外显子第790位点突变(即T790M基因突变)，这是EGFR对TKI耐药最主要的机制，其中19-del外显子缺失突变和21外显子L858R点突变是EGPR突变中最常见的两种亚型。明确患者EGFR基因突变状态，并在治疗过程中监测T790M耐药突变基因的出现，是晚期肺腺癌患者靶向治疗的关键。

临床采用血浆循环肿瘤DNA(circulating tumor DNA，ctDNA)进行EGFR基因突变检测，具有侵袭力低、反复获取等优势。但ctDNA在血浆中含量极微，因此迫切需要高灵敏度的检测方法来检测血浆ctDNA中的EGFR基因突变状态[4]。目前研究[5-8]显示，Super-ARMS PCR 具有较高的特异度，但其灵敏度相对较低，假阴率较高。据2016年全国ctDNA基因突变检测室间质量评价调查活动结果报告显示，采用二代测序(next-generation sequencing，NGS)法的实验室结果符合率为79.1%、ARMS-PCR符合率为78.6%，而采用数字PCR的实验室符合率为100%。因此，应用数字PCR检测可明显提高ctDNA基因突变的检出率。但既往研究多采用微滴数字PCR对EGFR基因突变状态进行检测，仅可检测突变丰度为0.001%的突变样本[9-10]。既往研究[11]采用芯片式数字PCR对使用EGFR-TKI的患者进行耐药突变T790M的监测，其相比于NGS具有更高的灵敏度。本研究应用基于芯片的数字PCR产品，将样本分为20 000个独立的反应单元，分散于20 000个微孔集成在一张100 mm2的芯片上，在隔绝外部污染的密闭芯片中进行PCR扩增，通过芯片式数字PCR对晚期肺腺癌患者血浆ctDNA中EGFR基因突变情况进行检测，借以验证数字PCR在血浆EGFR基因突变检测中的临床可用性。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病例筛选 选取2017年7月至2017年12月于川北医学院附属医院收治的26例按国际肺癌研究协会(IASLC)(第八版)肺癌TNM分期[12]确诊为III～IV期肺腺癌患者为研究对象，患者年龄48～79岁，其余临床资料包含性别、吸烟史等。患者均由病理活检确诊。本研究经院伦理委员会审核批准，患者及家属知情同意。排除其他肿瘤疾病，且已经过靶向治疗和新辅助化疗患者。

1.1.2 主要仪器与耗材 PAXgene Blood ccfDNA Tube(德国Qiagen公司)、芯片式数字聚合酶链式反应(dPCR)分析系统(南京科维思公司)、迷你离心机、恒温金属浴、37 ℃水浴箱、Eppendorf台式高速冷冻离心机(德国艾本德公司)、移液器(德国艾本德公司)、微型旋涡混匀器、QIAamp DNA Blood Mini Kit(德国Qiagen公司)、DNA Clean&Concentrator-5(Zymo Research公司)、EGFR基因 L858R突变检测试剂盒(南京科维思公司)、EGFR基因19DEL突变检测试剂盒(南京科维思公司)、无水乙醇、异丙醇。

1.2 方法

1.2.1 标本采集 应用PAXgene Blood ccfDNA Tube采血管经肘正中静脉收集患者外周血样本10 mL，1 900×g低速离心15 min，分离血浆于-80 ℃冰箱冻存待用。

1.2.2 血浆ctDNA抽提 将血浆按QIAGEN公司QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit提取试剂说明提取血浆ctDNA，再采用DNA Clean&Concentrator-5浓缩提纯DNA，OD260 nm /OD280 nm=1.8～2.0，放入-80 ℃冰箱冻存待用。

1.2.3 数字PCR实验 (1)将所有试剂及样本置于冰上融化，颠倒混匀、离心后置于管架上，同时将芯片上样器打开预热，配制L858R和19del反应混合液，总体积为14.5 μL，包含7.25 μL数字PCR反应液，0.72 μL EGFR基因19DEL突变检测反应液，6.53 μL DNA样本，每批样本包含1个阴性质控品，1个阳性质控品。(2)反应芯片的制备：将数字PCR通用芯片和上样槽安装到芯片上样器上，用移液器将14.5 μL反应混合液加入到上样槽中。按下工作按钮将反应混合液均匀的涂到数字PCR通用芯片上，将补液器安装到芯片填充液前端，在芯片表面加入数滴芯片填充液，以覆盖整个芯片表面，盖上芯片密封盖，按压15 s，取下芯片组件，注入芯片填充液，将芯片密封好，并将其置于紫外灯下固化。(3)dPCR扩增：将制好的芯片按以下反应体系进行扩增：96 ℃ 10 min，60 ℃ 2 min，98 ℃ 30 s，39个循环；60 ℃ 2 min，1个循环；10 ℃，保温待数据分析。(4)将芯片在dPCR扩增仪中放置10 min后从仪器中拿出，室温避光静置15 min，平衡温度至室温。平衡后的芯片依次放入dPCR分析仪中，识读芯片唯一标识符并捕获样本所有反应孔FAM、VIC、ROX通道的荧光信号，ROX通道用于判断是否有样本存在，从而确定病例突变状态。

1.2.4 阳性判断标准 FAM阳性孔/(VIC阳性孔+FAM阳性孔)比值>0.1%为阳性，≤0.1%为阴性。

1.2.5 质量控制 阳性质控品的FAM阳性孔/(VIC阳性孔+FAM阳性孔)比值应>0.1%，阴性质控品FAM阳性孔/(VIC阳性孔+FAM阳性孔)比值应≤0.1%。

1.3 统计学分析

采用SPSS24.0软件对数据进行分析与处理。计数资料以[n(%)]表示，采用Fisher确切概率法；相关性采用Pearson相关性分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 数字PCR检测血浆ctDNA EGFR基因突变结果

26例患者中，检出基因突变6例，突变检出率为23.1%，其中19del突变两例，L858R突变3例，19del及L858R双突变1例。见表1及图1。

表1 数字PCR检测EGFR基因19del、L858R突变结果

2.2 血浆ctDNA EGFR突变状态与临床特征的相关性

相关性分析显示，EGFR基因突变与患者性别、年龄、吸烟史无相关性(P>0.05)，而肿瘤分期与EGFR基因突变状态有相关性(P<0.05)。见表2。

表2 血浆ctDNA EGFR突变结果与临床特征的关系[n(%)]

3 讨论

EGFR基因是NSCLC的主要驱动基因，突变较易发生于亚裔、女性、腺癌、不吸烟或少吸烟的患者，分子靶向药物TKI靶向治疗可有效改善EGFR基因敏感突变携带者的预后[13-14]。19-del和L858R是EGFR最常见的敏感突变位点，19del突变患者临床首选EGFR-TKI靶向治疗，L858R突变患者临床首选抗血管生成药物联合EGFR-TKI治疗。ctDNA是一种可代替肿瘤组织检测肿瘤特异性改变的样本，其在取材安全无创、动态监测、不受肿瘤异质性的影响有着无可比拟的优势，但其在循环系统中的丰度极低，易受到高浓度野生型血浆游离DNA的干扰，且呈高度片段化，因此需要灵敏度极高的方法对血浆EGFR基因突变进行检测。

目前，EGFR检测常见方法有ARMS法、聚合酶链反应技术或NGS技术等，这些检测方法要么敏感度有限无法满足临床需求，要么操作复杂、技术难度高，成本高。数字PCR是一种可以通过分析血浆ctDNA对低频突变检测，从而确定NSCLC患者EGFR基因突变状态，对比于常规ARMS法具有更高的灵敏度。芯片式数字PCR由于其整个扩增反应都在密闭的芯片中进行，相较于ddPCR减少了外界污染带来的影响，同时其结果判读简单、直观，更适于临床工作人员使用，是目前CDFA唯一批准进入临床检测的数字PCR。

本研究基于具有高灵敏度的芯片式数字PCR法对26例未进行抗肿瘤治疗的III～IV期肺腺癌患者进行血浆19-del和L858R突变位点检测，共检测出EGFR基因突变6例，突变率为0.11%～2.23%，其中L858R突变检出率为15.4%(4/26)，19del突变检出率为11.5%(3/26)，略低于Yung等[11]的结果，原因可能为本研究样本量有限，结果可能存在偏倚；本研究患者与其存在结构异质性(如不同肿瘤分期患者比例不同)。

相关性分析显示，EGFR基因突变状态与患者性别、年龄、吸烟史无明显相关性(P>0.05)，而肿瘤分期与EGFR基因突变状态有相关性(P<0.05)，与Karachaliou等[15]的研究结果基本一致，可能是晚期EGFR基因突变状态与肿瘤分期相关。目前研究[16]指出，在不考虑肿瘤组织EGFR基因突变状态的晚期NSCLC患者中，对血浆ctDNA进行EGFR基因突变检测，结合肿瘤分期显示，IV期病例相较于III期患者血浆EGFR突变检出率较高，可能是由于不同分期患者于血浆中释放的ctDNA含量不同所致，进一步证实了血浆ctDNA EGFR基因突变检出率可能与患者肿瘤分期有关。

本研究应用数字PCR对ctDNA EGFR突变等位基因和野生型等位基因进行绝对定量，突变EGFR/突变EGFR+野生型EGFR的浓度比值定义为EGFR突变丰度。EGFR突变患者中，仅两例患者19-del突变阳性孔数>10，信号比值>1%，整体突变丰度水平较低。Yang等[17]研究指出，对于EGFR基因突变丰度>5.15%的患者采用EGFR-TKI具有更好的PFS。Yung等[11]研究显示，NSCLC部分缓解和完全缓解的患者EGFR突变序列浓度降低，而疾病进展患者突变持续存在。研究提示，应用数字PCR技术不仅仅局限于指导靶向治疗的用药，还可基于数字PCR的绝对定量的优势，检测EGFR突变丰度，通过突变丰度及其变化预测NSCLC疾病的转归及EGFR-TKI的疗效。

本实验也存在一定不足：(1)由于样本量的限制，结果可能存在偏倚；(2)无法排除由于技术操作、样本因素所导致的假阴性结果；(3)虽然数字PCR设备已获得CFDA批准上市，但迄今为止暂无CFDA批准的数字PCR检测试剂盒；(4)由于检测所需血浆样本量较大，本实验仅检测了19del突变及L858R突变，未明确26例患者中是否存在原发性T790M耐药，后续可在靶向用药过程中采用芯片式数字PCR继续随访患者T790M耐药突变。

综上，芯片式数字PCR在晚期肺腺癌患者的血浆ctDNA中可以检出EGFR突变，可为临床医生进行治疗决策提供一定的理论依据。