牛支原体感染诊断方法的研究进展

胡 园，马景新，杨发龙

（西南民族大学畜牧兽医学院，四川 成都 610041）

牛支原体被认为是世界范围内与牛疾病相关的最重要及最常见的病原之一，可以引起牛的呼吸道疾病、生殖系统疾病、乳房炎及关节炎等。牛支原体最早于1961 年从美国患有乳房炎的奶牛中分离，1976年有研究报道其与各类牛呼吸系统疾病有关。随即，牛支原体引起的相关疾病快速蔓延到多个国家及地区的牛群，给养牛业造成了巨大的经济损失。本文就目前几种实验室诊断牛支原体的方法进行阐述，以期为临床上牛支原体病的防控提供参考。

1 微生物学诊断

传统的牛支原体种类鉴定和检测是通过微生物培养进行的。由于支原体的结构简单，不能合成氨基酸，也不能完全或部分合成脂肪酸。为了满足这种高营养需求，通常选用富含牛心浸出液、血清、酵母提取物、蛋白胨和其他补充物的培养基，且培养基最终pH值应为7.3～7.8。为避免培养分离的支原体受到其他生长较快的细菌的影响，还应在培养基中加入如乙酸铊或抗生素之类的抗菌剂。

1.1 初步诊断 在牛支原体的分离培养时首先要进行样本采集，将患病动物的组织病料收集到无菌试管或容器中，冷藏保存，并尽快运送至实验室培养。无菌条件下将样本接种于固体培养基上，于37 ℃且含5% CO2的条件下培养7～10 d，直到长出大多数支原体的菌落，在光学显微镜下观察呈“煎蛋”状；随后接种于含有酚红的液体培养基中，培养基颜色会由红色变为黄色，之后根据相关的生化反应进行鉴定［1］。

1.2 鉴别诊断 由于支原体生长培养基有可能长出柔膜体纲的其他几种微生物，添加的抗菌剂通常会抑制其他细菌的生长。鉴于大多数种类的无胆甾原体和支原体都具有“煎蛋”样形态，故利用对洋地黄皂苷的敏感性来区分支原体和无胆甾原体。在含有饱和1.5%洋地黄皂苷的纸片上，支原体周围存在一个大的抑菌圈，而无胆甾原体属只有较小的抑菌圈，甚至不存在抑菌圈［2］。判定为支原体后，还应通过聚合酶链式反应（PCR）等方法来进行物种鉴定。

病原分离培养作为检测牛支原体的传统方法，其准确性较高，但实验操作烦琐、稳定性低、灵敏性低且难度大，培养周期较长，往往贻误最佳治疗时间，因而不适宜广泛应用。

2 分子诊断

2.1 常规PCR检测 20世纪90年代，以16S rRNA基因为靶点的牛支原体常规PCR 检测方法开始应用［3］。基于牛支原体16S rRNA 的PCR 检测虽然对大多数支原体的特异性较好，但对影响小反刍动物的无乳支原体的特异性却较低［4］。为了检测多个种属的支原体，设计了一种以16S～23S rRNA间隔区为靶点的PCR 方法来区别支原体和无胆甾原体。也有采用类似的方法，使用支原体特异性引物靶向16S rRNA基因，然后使用变性梯度凝胶电泳（DGGE）分离PCR产物。这种方法能够鉴别和区分67种具有公共卫生学意义的支原体，并有助于检测混合培养物［5］。

2.2 实时PCR检测 虽然常规PCR检测与病原分离培养相比具有多种优点，但常规PCR要在循环结束时检测PCR产物的量，不能及时对病原体做出诊断。随着实时PCR技术的发展，应用于支原体的检测方法主要有SYBR Green染料法和荧光探针法。

2.2.1 SYBR Green染料法SYBR Green 染 料能与所有双链DNA 结合，在特定波长520 nm 处可进行检测。随着PCR 循环的进行，目标双链DNA数量的增加，染料发出的光数量也呈正比例递增，从而实现PCR产物的实时检测。这种方法不太常用于检测牛支原体，但可用于检测牛奶样本中的其他支原体。

2.2.2 荧光探针法 为了获得更高的特异性，实时PCR的荧光探针法采用降解探针，除了引物杂交，探针还与引物结合位点内部的靶区结合［6］。由于降解探针对目标序列具有特异性，大大降低了背景信号，提高检测的特异性。尽管探针PCR具有更高的特异性，但当以牛支原体16S rRNA基因为靶点时，仍可能发生无乳支原体的交叉扩增。因此，对替代基因的使用进行了研究。

已经证明uvrC 基因是牛支原体较好的PCR靶点，与包括无乳支原体在内的非牛支原体没有交叉扩增。uvrC 基因编码中的脱氧核糖嘧啶光解酶，是一种与DNA 修复有关的复制所必需的酶，能够使其成为一个高度稳定的基因。它在牛支原体和无乳支原体中都是一个稳定良好又显著不同的基因，使其成为比16S rRNA更为特异的靶基因。oppD/F 基因和牛支原体特异性探针的使用已经被证明了可以增加PCR 检测的特异性。进一步研究表明，将针对oppD基因的牛支原体特异性PCR与DNA微阵列技术结合使用，可以在小牛的鼻拭子和气管分离物中鉴定出70 多种支原体［7］。

最近的一项研究发现了3种基于探针的实时PCR方法，用于检测牛乳和组织样本中的牛支原体、加利福尼亚支原体和牛生殖道支原体［8］，并为这三种支原体选择了三个不同的靶基因：牛支原体的靶基因是fusA，主要编码mRNA 转化为蛋白质过程中所必需的延伸因子G；加利福尼亚支原体的靶基因是编码RNA聚合酶b亚单位的rpoB，该酶是一种在DNA复制转录过程中催化RNA合成的酶；牛生殖道支原体靶基因是16S～23S rRNA基因间隔区。特异性分析显示，牛支原体与其他柔膜体纲微生物之间没有交叉扩增。据此，认为新发现的3 种探针分析方法比部分16S rRNA 基因测序作为参照标准更为准确。

2.3 其他分子诊断方法 现有脉冲场凝胶电泳（PFGE）、扩增片段长度多态性（AFLP）、多位点可变数目串联重复序列分析（MLVA）和多位点序列分型（MLST）等方法可以对牛支原体进行遗传鉴定。

2.3.1 脉冲场凝胶电泳 脉冲场凝胶电泳是20世纪80 年代初发展起来的一种用于支原体菌株分型和鉴定的电泳方法。曾有一项研究调查了6个牛养殖场的支原体疾病，通过检测，发现39 个样本的PFGE 结果相同，表明牛支原体菌株在牛群中水平传播，在临床症状消失后，同一菌株又能在牛群内的小牛体内持续存在［9］。

2.3.2 扩增片段长度多态性分析 扩增片段长度多态性是一种基于PCR的DNA指纹分析技术，包括用限制性内切酶消化DNA，选择性扩增一部分限制性片段，然后对这些片段进行凝胶检测。曾有人利用该技术分析了42 头丹麦牛支原体分离株在1981～1998 年17 年间的遗传变异，以监测其遗传相关性［10］。

2.3.3 MLST和MLVA 多位点序列分型（MLST）是基于分离株基因组中的几个可被分析出独特序列的基因，根据这些独特序列来确定其遗传关系。多位点可变数目串联重复序列分析（MLVA）使用PCR扩增DNA的区域，这些区域包含重复序列，而这些重复序列往往不稳定，因此可以根据所选位点的重复次数来区分不同的分离株。对牛支原体分离株的基因分型，一般把这两种方法结合起来，首先用MLST对菌株进行鉴定，然后用MLVA进行准确分型。

2.3.4 全基因组测序分析 现在也有研究使用全基因组测序（WGS）来分析比较大量分离株之间的遗传多样性。WGS 包括对选定菌株的全基因组进行测序，然后用于临床诊断、流行病学调查和控制抗生素耐药性等。对分离株的完整测序分析也增加了对病原体的了解，并揭示和预测了一些毒力基因。

3 血清学诊断

微生物培养和PCR 检测更多的是为了证明支原体的存在，而间接ELISA 是通过证明血浆、血清和牛奶样本中存在抗支原体抗体来达到诊断的目的［11］。

3.1 间接ELISA 间接ELISA 是检测动物对牛支原体免疫反应的一种辅助手段，克服了微生物培养和PCR 检测的一些不足［12］。虽然微生物培养和PCR 取决于采样动物所分离的微生物，但ELISA 能够以体液免疫抗体反应的形式检测病原感染后的情况，体液抗体反应通常在感染后持续一段时间。当这些诊断方法同时使用时，ELISA 检测到的牛支原体阳性率通常要比PCR或分离培养法高得多。然而，牛支原体抗体的存在并不意味着动物一定有牛支原体病原。这一点在牛支原体乳房炎暴发的情况下得到了证实，在感染奶牛都被淘汰后，牛群中剩余的其他奶牛尽管没有发病，但ELISA 结果仍呈阳性［13］。仅根据ELISA 结果来扑杀动物并不是控制疫情的合理手段，而且可能会导致扑杀过度。因此，ELISA结果应结合其他诊断方法来共同确定。

3.2 抗体水平监测 关于抗体持续时间，一项关于小型奶牛场的研究发现，在牛支原体感染开始后27周和观察到末例临床病例后15周，94%留在牛群中的动物血清中的牛支原体抗体呈阳性。然而，虽然抗体在血清中的持续时间可能会很长，但在牛奶样本中的情况可能并非如此。与血清样品相比，牛奶样品中的牛支原体抗体水平可能要低得多，甚至可能检测不到，也许是由于血清抗体渗入乳房所致。乳清中的免疫球蛋白浓度明显低于血清，一些免疫球蛋白（包括IgM和IgA）在乳房局部产生，但IgG 通常是ELISA 的靶点，在血液中产生并转移到牛奶中［14］。因此，用ELISA 检测到的牛支原体抗体在血清中的含量高于牛奶样品并不奇怪。

4 小结

支原体能够在牛群中引起严重疾病，对经济效益造成重大负面影响。面对疾病的暴发，做出快速而准确的诊断来有效防控尤为重要。就微生物学诊断来看，尽管取得结果很慢，但却培养出了一种确定的分离株，用于DNA 提取和分型，可以调查感染源和分离株与其他微生物的关系。PCR 检测提供的快速诊断结果有助于及时提出针对感染牛群的解决方案，以降低疾病传播的风险。血清学诊断便于为不同畜群或畜群内特定个体的近期感染情况做出评估。临床上，应从预算成本、诊断的紧迫性、检测的实用性、样本类型和处理条件等方面选用诊断方法。尽管每种诊断方法都有局限性，但联合使用将会取长补短。■