NEK2与肿瘤侵袭转移及耐药性的研究进展

姜志平，李风艳

0 引言

蛋白激酶(Protein kinases，PKs)占人类基因组所有基因的1.7%，通过改变底物活性或位置，与其他蛋白相互作用或通过控制代谢、转录、细胞周期进程、细胞骨架重排、细胞运动、细胞凋亡和分化来介导真核细胞中的大多数信号转导过程[1]。PKs调节细胞周期，特别是在检查点过程中，是肿瘤中备受关注的治疗标靶。其中，永不参与有丝分裂蛋白(Never in mitosis gene A,NIMA)在调节细胞周期的不同方面起着至关重要的作用。NIMA最初是在真菌曲霉中被发现的丝氨酸/苏氨酸激酶(79kDa)，对进入有丝分裂至关重要。研究表明，NIMA在细胞分裂的所有阶段均发挥作用[2]。在哺乳动物中，有11种PKs在其催化结构域中与NIMA具有40%～50%的氨基酸序列同一性[3]，因此被称为NEKs-NIMA相关激酶(NIMA related kinases，NEKs)。

中心体分离相关激酶(Never in mitosis gene A related kinase，NEKs)是代表NEK1-NEK11[4]的丝氨酸/苏氨酸激酶家族，定位于纤毛、中心体、细胞核、细胞质和线粒体中[1]。大量研究表明，NEKs参与多种细胞功能，并且因与癌症发展相关的靶标通路相关，其家族内成员成为备受关注的药物靶标[5]。其中，NEK2是由NEK2基因编码的位于中心体的丝氨酸/苏氨酸激酶，是细胞周期进程中必不可少的酶，尤其是在通过磷酸化不同底物的有丝分裂调控中[6]。由于NEK2在调节细胞周期进程中起关键作用，通常在中心体分离、微管组织、染色质凝结和纺锤体装配检查点中发挥重要作用，因此其上调直接导致细胞周期失调[7]。NEK2水平上调会导致中心体异常和单极纺锤体形成，并通过破坏有丝分裂检查点的控制来促进非整倍性[8]。越来越多的研究表明，NEK2在肿瘤中的表达增加，并且NEK2的上调与多种类型的肿瘤进展、耐药性、不良预后密切相关[9]。因此，本文就NEK2在肿瘤侵袭转移及耐药性中的作用机制作一综述。

1 NEK2的结构及其剪接异构体

人类的NEK2基因位于1号染色体上，由8个外显子组成。NEK2是最接近NIMA的哺乳动物同种型，其结构具有位于氨基末端的丝氨酸-苏氨酸结构域和多个调节基序，如亮氨酸拉链、卷曲螺旋、中心体和微管定位位点、蛋白磷酸酶1(Protein phosphatase 1，PP1)结合位点、KEN-box、核仁定位位点、后期促进复合物(Anaphase-promoting complex，APC)结合位点和位于羧基末端位点的破坏盒(Destruction box，D-box)[10]。哺乳动物中的NEK2具有3个剪接异构体：NEK2A、NEK2B和NEK2C。

NEK2A是研究最多的剪接异构体，是全长蛋白质，在细胞核和细胞质内均匀分布[5]。其在催化结构域上与NIMA的同一性为47%，与Aurora-A(一种参与正常细胞分裂的人丝氨酸/苏氨酸激酶)在结构上也有31%相同[11]。人NEK2A是由445个氨基酸(48 kDa)构成的蛋白质，包含N端激酶结构域和C端非催化调节结构域。NEK2A N末端激酶结构域具有丝氨酸/苏氨酸激酶的所有典型基序。C末端区域具有多个调节基序，调节NEK2A的活性、位置和稳定性。有研究表明，NEK2A可能在调节细胞有丝分裂中起作用，如纺锤体检查点信号和染色体分离[12]。

NEK2B是长度为384个氨基酸(44 kDa)的蛋白质，通过使用末端内含子内的另一个聚腺苷酸化位点产生，与NEK2A的羧基末端不同，主要分布在细胞质中[5]，贯穿有丝分裂整个过程。它可以通过其底物的可逆磷酸化来调节有丝分裂中心体的分离，从而调节中心体的聚集和分离[13-14]。Fletcher等[12]证明,仅NEK2B的下调会导致细胞有丝分裂延迟，从而导致有丝分裂缺陷，如形成多核细胞。

NEK2C来自另一剪接事件，从全长蛋白质的羧基末端结构域中切除了8个氨基酸序列，与许多在有丝分裂中起作用的蛋白激酶相似，主要分布在细胞核中[5]。

2 NEK2在肿瘤中的作用

在细胞周期的G1期，NEK2表达较低，在S期和G2期升高，在G2/M后期达到峰值，并在细胞进入有丝分裂时降低。与其他阶段相比，S期和G2期的NEK2活性更强。NEK2在细胞周期的G2/M期开始中心体分离。NEK2过表达导致癌细胞中染色体不稳定和非整倍性。此外，NEK2过表达激活了几种致癌途径和ATP结合盒转运蛋白，从而导致异常细胞分化、肿瘤增殖、耐药性和预后不良[15]。有研究表明，NEK2耗竭影响了动植物微管的附着，导致纺锤体检查点失衡和着丝粒成分异常聚集，从而导致细胞对靶向微管的抗癌药物紫杉醇(Paclitaxel，PTX)的敏感性增加[16]。NEK2耗竭的细胞具有通过不同类别诱导异常有丝分裂的特征。首先，NEK2耗竭会干扰中心体复制或成熟以及包括γ-微管蛋白、P1k1(一种细胞周期激酶)和核磷素/B23在内的蛋白质在有丝分裂纺锤体极上的排列。其次，NEK2耗竭诱导人类细胞中异常的染色体分离。再次，NEK2耗竭干扰中心体分离的调控。最后，由于有丝分裂错误，NEK2耗竭会导致细胞增殖停滞并增加凋亡[17]。

3 NEK2与肿瘤侵袭转移及耐药性

3.1 NEK2与乳腺癌侵袭转移及耐药性 乳腺癌(Breast cancer，BC)是女性第二大主要死因。根据雌激素受体(Estrogen receptor，ER)、孕激素受体(Progesterone receptor，PR)和ErbB-2/人类表皮生长因子受体2(Human epidermal growth factor receptor 2，HER-2)的表达情况分成4种亚型，分别为：ER/PR+/Her2-、ER/PR/Her2+、ER/PR-/Her2+和ER/PR/Her2-(三阴性)。在所有乳腺癌类型中，平均复发时间为5年，而三阴性乳腺癌(Triple-negative breast cancer，TNBC)的平均复发时间为2.6年，与患者生存不良有关[18]。与其他亚型相比，TNBC由于潜在靶向分子的缺乏，治疗更加困难。PTX是单独或与其他抗肿瘤药如吉西他滨或蒽环类药物联合使用的、TNBC患者最常用的细胞毒性化疗药物之一。PTX最初对TNBC有效，但因剂量限制的毒性和耐药性的迅速发展而受到抑制。Roberts等[19]以TNBC作为模型，对PTX抗药性的可治疗靶向介体进行了研究。有报道，LIN9(细胞周期进程的转录调节因子)的过表达与BC预后较差有关，而在TNBC病例中约65%的LIN9过表达[20]。Roberts等[19]发现，在TNBC PTX抗性细胞中，LIN9及其下游转录标靶NEK2表达水平上调，通过药理学抑制或通过遗传抑制LIN9或NEK2可使细胞对PTX敏感并逆转PTX耐药性，表明LIN9/NEK2途径是PTX抗药性的可治疗靶向介质，可用于改善对该核心化学疗法的反应。

3.2 NEK2与卵巢癌侵袭转移及耐药性 卵巢癌(Ovarian cancer，OC)因临床表现晚、复发率高而被认为是最致命的妇科恶性肿瘤[21]。晚期OC患者5年生存率低至25%，OC是女性死亡的第5大主要原因[22]。PCAT1是在转移性前列腺癌组织中高度表达的长链非编码RNA(Long non-coding RNA，lncRNA)，在多种肿瘤中起上调癌基因的作用[23]。NEK2被生物信息学预测为PCAT1的潜在靶基因。Liu等[24]在OC细胞系OVCAR3、A2780中发现，PCAT1过表达后，NEK2的mRNA和蛋白水平均显著上调；siRNA转染沉默NEK2的表达后，显著抑制了OC细胞的迁移能力；在PCAT1转染的OVCAR3、A2780中，Wnt通路中β-catenin、Cyclin D1和C-myc显著上调，表明Wnt通路激活；而敲低NEK2的表达可以消除PCAT1诱导的Wnt通路的激活，表明NEK2可能通过PCAT1/Wnt/NEK2通路调节OC细胞的侵袭转移。Xia等[25]对PTX抗性OC组织(SKOV3/PTX)进行研究，发现NEK2明显升高，当circTNPO3(一种环状RNA，circRNA)敲低或miR-1299过表达可使SKOV3/PTX的NEK2极大下降，添加miR-1299抑制剂后，NEK2下降程度明显恢复，提示OC PTX抗性中可能存在circTNPO3/miR-1299/NEK2轴。Uddin等[26]对OC组织获得性顺铂耐药性(Development of acquired resistance to cisplatin，CDDP)的发展进行研究，发现干细胞相关基因ALDH1A1在耐药(A2780-Cp)/超耐药(SKOV3-Cp)细胞中均过表达，siRNA沉默A2780和A2780-Cp细胞中的ALDH1A1大大减少了干细胞的数量，并使细胞对CDDP敏感；ALDH1A1沉默降低了其下游目标NEK2的转录和蛋白质水平；同时发现ALDH1A1或NEK2沉默导致ABC转运蛋白(ABCB1/MDR1、ABCG2和ABCC1/MRP1)的下调，NEK2过表达导致ABCB1/MDR1的上调，提示ALDH1A1-NEK2-ABC转运蛋白途径参与OC组织CDDP抗性。

3.3 NEK2与肝细胞癌侵袭转移及耐药性 肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma，HCC)的发病率和死亡率较高，是全世界与肿瘤相关死亡的第三大主要原因[27]。早期HCC患者的5年生存率超过70%，而晚期HCC患者的5年生存率不到5%[28]。Lai等[29]通过免疫组化检测了52个HCC组织中NEK2的表达，发现其表达程度明显上升；经NEK2 siRNA转染的人HCC细胞HepG2细胞增殖、集落形成及细胞活力显著降低；细胞凋亡分析表明，NEK2 siRNA转染的HepG2细胞呈现出比对照组高得多的凋亡指数；蛋白质印迹分析表明，NEK2 siRNA转染的HepG2细胞中，β-catenin、C-Myc、CycD1、CycB1、CDK1和CycE蛋白的表达减少，这些蛋白都参与细胞生长和增殖相关的β-catenin/Wnt途径，表明NEK2通过调节β-catenin/Wnt途径诱导HCC细胞周期进程和增殖。索拉非尼是晚期HCC患者的一线治疗药物，与总体生存获益相关，但缓解率并不令人满意[30]。Deng等[31]对与索拉非尼耐药相关的机制进行了研究，发现NEK2过表达抑制了索拉非尼治疗诱导的细胞凋亡和生长抑制，而沉默NEK2后显著加强了索拉非尼治疗效果；异种移植肿瘤模型显示，与敲除NEK2或仅索拉非尼治疗组相比，NEK2抑制和索拉非尼治疗的组合可显著抑制肿瘤生长；发现NEK2可以结合索拉非尼治疗的HCC细胞系中的β-catenin，并调节其泛素化，促进其核转运，从而激活下游靶基因的转录，并且证实NEK2/β-catenin可促进HCC对索拉非尼的耐药性。另一项关于HCC耐药性的研究发现，过表达的NEK2在HCC中通过促进PP1/Akt和Wnt途径活化而促进HCC的进展和耐药性[32]。

3.4 NEK2与其他肿瘤侵袭转移及耐药性 NEK2还参与其他肿瘤的侵袭转移及耐药性。宫颈癌(Cervical cancer，CC)也是妇科常见恶性肿瘤之一，每年约有45万新诊断病例[33]。Ji等[34]对72个CC组织、54个癌旁组织及CC细胞系HeLa进行研究，发现NEK2可能通过lncRNA SNHG1/miR-195/NEK2轴参与CC的发生发展。目前，CC的主要诊疗方式是手术、放疗、化疗和免疫疗法。对于局部晚期CC患者，同时放化疗可明显改善其生存。但癌细胞的抗辐射性被认为是治疗失败的主要因素。Xu等[35]对CC放射线耐药相关机制进行研究，发现NEK2通过诱导Wnt1的表达以激活Wnt/β-catenin轴，从而导致CC的发生和放射抵抗。神经胶质瘤是较为常见的脑肿瘤，主要治疗方式包括：药物治疗、手术切除和放疗。其中，放疗是辅助治疗方法，对神经胶质瘤患者的生存有利。但神经胶质瘤的放射抗性使其治疗效果大打折扣[36]。Guan等[37]的研究发现，在神经胶质瘤组织和细胞中，circPITX1(一种circRNA)和NEK2的表达上调，而miR-329-3p的表达下降；双荧光素酶报告基因测定证实在神经胶质瘤中存在circPITX1/miR-329-3p/NEK2轴，并参与其放射抗性。胰腺癌由于其快速发展和对化疗的耐药性，是最难治的癌症之一。Kokuryo等[38]在胰腺癌细胞系中发现了NEK2的过表达，在胰腺癌异种移植小鼠模型中，使用荧光标记的NEK2 siRNA和脂质体混合物通过门静脉导管系统给药，1 h后在肝脏中鉴定出来荧光标记的NEK2 siRNA，并且发现NEK2 siRNA抑制了腹膜扩散中的肿瘤生长，减少了肝转移的数量和面积，延长了模型小鼠的存活时间，由此提出沉默NEK2有望成为具有肝转移和腹膜扩散的胰腺癌的一种新型治疗策略。非小细胞肺癌(Non-small cell lung cancer，NSCLC)约占所有肺癌病例的85%[39]。表皮生长因子受体(Epidermal growth factor receptor，EGFR)基因的酪氨酸激酶(Tyrosine kinase，TK)结构域内的突变，与NSCLC的发生发展有关。EGFR的酪氨酸激酶抑制剂(Tyrosine kinase inhibitors，TKIs)已作为晚期EGFR突变型NSCLC的一线治疗。接受EGFR-TKIs治疗的大部分患者显示出良好的治疗反应，与化疗相比，其无进展生存期和总生存期也大大提高，但大多数患者最终会产生耐药性，这是治疗失败的主要原因[40]。Chen等[41]发现，EGFR突变通过激活ERK信号传导途径诱导NEK2表达，升高的NEK2促进细胞周期快速发展、EGFR突变的NSCLC细胞快速增殖，并抑制细胞凋亡，从而削弱TKIs治疗效果，而耗竭NEK2的表达可以抑制癌细胞快速生长，并提高EGFR-TKIs的功效，提示NEK2可能为克服耐药性、改善EGFR突变的NSCLC患者预后的生物学标志物。

4 结语

NEK2可以通过多种信号传导途径参与人类恶性肿瘤细胞增殖、迁移、侵袭、转移及耐药。恶性肿瘤治疗效果常因耐药性而不尽人意。因此，继续深入研究NEK2在恶性肿瘤细胞侵袭转移及耐药性中的作用机制，对于恶性肿瘤靶向治疗、克服耐药性有重大意义。