巨噬细胞及其外泌体microRNAs在肝病中的作用

卢旺 白丽 陈煜

肝脏疾病是世界范围内重大的公共卫生问题，全球每年约有200万人死于肝病，约116万人死于肝硬化及其并发症，78.8万人死于肝癌，这些疾病加起来约占全世界死亡人数的3.5%[1]。如果将非酒精性脂肪性肝病、酒精性肝病、药物性肝病以及遗传代谢性肝病等死亡原因纳入其中，全球因肝病而死亡的患者比例将更高。因此，探究肝病发病新机制，以期获取新的有效治疗策略，是目前亟待解决的难题。近期von Meijenfeldt等研究证实了中性粒细胞胞外诱捕网(NETs) 存在于急性肝衰竭 (ALF) 患者肝组织中，并且与ALF患者不良预后显著相关[2- 3]。巨噬细胞作为机体重要的先天性免疫细胞，因其独特的异质性和多功能特性，同样参与调控病毒性肝炎、脂肪肝、肝硬化、肝癌等多种肝病的病理过程，发挥着重要作用。外泌体(Exos)是细胞间物质及信号传递的重要媒介，其携带的微小RNAs(miRNA)可通过靶向下游信号分子调控多种肝病的发病机制。本文就巨噬细胞及其来源Exos携带的miRNAs在肝病中的作用作一总结，希望为肝病的临床诊断及治疗提供新靶点和新思路。

一、巨噬细胞及其来源外泌体miRNAs

(一)巨噬细胞 巨噬细胞作为重要的先天性免疫细胞，具有很强的可塑性和多功能特性。受周围微环境变化的影响，可通过JAK/STAT、TLR4/NF-κB、TGF-β/Smads、PPARγ、Notch和miRNA等信号通路极化为不同的表型，主要为经典活化(M1型)巨噬细胞和替代活化(M2型)巨噬细胞。也有研究报道了M3、M4型巨噬细胞，而M2型巨噬细胞还可进一步分为M2a、M2b、M2c和M2d亚型。M1型巨噬细胞具有较强的抗原提呈能力，能产生大量促炎细胞因子和趋化因子，如肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素(interleukin, IL)-1β、CXC趋化因子配体10(CXCL10)等，可募集循环单核细胞和淋巴细胞进入肝脏，在炎症反应、病原体清除、肿瘤抑制等过程中发挥重要作用。M2型巨噬细胞则主要产生抗炎细胞因子，如IL-10、IL-13、转化生长因子-β(TGF-β)等，在抑制炎症反应、免疫调节/耐受、血管生成、组织愈合及修复等过程中发挥作用。组织中巨噬细胞同时表达M1和M2活化标志物，其平衡倾向决定了巨噬细胞最终执行促炎损伤还是抗炎保护功能[4]。

(二)外泌体及其携带的miRNAs Exos是直径30～150 nm、密度1.13～1.19 g/mL的圆盘状或杯状双层膜包裹的纳米囊泡，由质膜和核内体膜出芽产生。几乎所有细胞均可分泌Exos。起初认为Exos是细胞分泌的代谢废物，后研究发现其携带的多种生物活性物质，如脂质、蛋白质、核酸等，可被远端靶细胞摄取，改变靶细胞的基因表达和功能，形成一种独特的细胞间信号传递模式，在人类健康和疾病中发挥重要作用。

研究较多并已证实具有重要调控意义的Exos内容物为miRNAs。miRNA是一类长度约22个核苷酸的高度保守的内源性非编码RNA，可通过降解信使RNA(mRNA)或抑制转录后翻译调控靶基因表达。最新研究证实，Exos中miRNAs存在主动分选机制，miRNAs具有决定其是被筛选入Exos分泌到细胞外还是驻留在细胞本身的核酸序列，且不同细胞类型优先使用特定的排序序列。重编程miRNAs可调控Exos中miRNAs的分泌，进而调控下游靶基因表达。此外，还有两种miRNA结合蛋白(Alyref 和Fus)参与了miRNAs的输出。该研究系统地阐述了Exos中miRNAs的组学数据，并严谨论证了Exos中miRNAs的分选机制，不仅将循环Exos中miRNAs与组织起源联系起来，还为RNA靶向治疗提供了理论依据和方法[5]。目前，Exos已逐渐成为新兴的重要非侵入性检测手段，为疾病早期诊断提供帮助。Exos也因其免疫原性低、生物相容性好、结构稳定等特点，有望作为天然药物递送载体，为新药研发和疾病治疗提供新靶点和新方向。

二、巨噬细胞及其外泌体miRNAs在肝病中的作用

(一)病毒性肝炎 病毒性肝炎以乙型肝炎病毒(HBV)或丙型肝炎病毒(HCV)感染最为常见，感染后易发生慢性化。全球有超过2.57亿慢性HBV感染者，超过1.8亿慢性HCV感染者。慢性HBV或HCV感染可增加肝硬化、肝癌的发生风险，每年有超过80万人死于HBV感染[6- 7]。巨噬细胞作为重要的天然免疫细胞，是抵御病原体的第一道防线。肝脏巨噬细胞由固有巨噬细胞即库普弗细胞(KCs)和循环单核细胞衍生的巨噬细胞(MDMs)组成。当肝脏受病毒感染时，KCs首先识别危险信号并募集循环单核细胞，随后募集的循环单核细胞局部分化为巨噬细胞即MDMs。HBV感染初期，KCs和MDMs产生和释放促炎细胞因子(IL-6、IL-8、TNF-α、IL-1β)，并活化自然杀伤细胞，抑制HBV基因的表达和复制[8-9]。同样，HCV感染可通过激活NF-κB信号通路诱导巨噬细胞分泌IL-1β和IL-18[10]。在慢性HBV感染阶段，HBV可调控巨噬细胞功能，即促炎细胞因子(IL-6和IL-1β)分泌减少、抗炎细胞因子(IL-10)分泌增多，导致机体病毒清除功能受抑制，促进病毒感染的建立和持续感染状态[11]。慢性HCV感染可同样影响M1型巨噬细胞分化，损害CD8+ T细胞功能。因此，调节机体免疫系统以抑制肝炎病毒的复制和传播是治疗病毒性肝炎的关键。研究发现，干扰素(IFN)-α诱导的肝脏非实质细胞(LNPCs)(包括KCs和肝窦内皮细胞)的抗病毒效应可直接通过其分泌的Exos靶向传递给肝细胞。研究表明，IFN-α诱导LNPCs源性Exos所富含的蛋白(APOBEC3G)、mRNA(618种)和miRNA(hsa-miR-638、has-miR-4284 and hsa-miR-1260)的表达水平与非IFN-α诱导LNPCs源性Exos存在显著差异。这些差异表达的内容物存在抗HBV作用，但这种抗病毒效应是这些生物活性物质的共同作用还是其中某一分子的单独效应，还有待进一步研究[12]。此外，IFN-α可显著诱导巨噬细胞源性Exos中hsa-miR-193a-5p、hsa-miR-25-5p和hsa-miR-574-5p的表达，其中hsa-miR-574-5p可与HBV基因组 2750-2757位点结合从而抑制HBV复制[13]。在HCV感染中，Toll样受体(toll-like receptor , TLR)3激活的巨噬细胞能够分泌富含miRNA-29家族的Exos。miRNA-29具有抗HCV作用，抑制miRNA-29可恢复HCV复制[14]。

(二)非酒精性脂肪性肝病 非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)是一种与肥胖、胰岛素抵抗、2型糖尿病、高血压、高血脂和代谢相关的肝脏疾病。NAFLD全球患病率约为25%，且呈逐年上升趋势[15]。NAFLD包括非酒精性脂肪肝和非酒精性脂肪性肝炎(NASH)。研究显示，在NAFLD初期，巨噬细胞以促炎M1型为主，可分泌促炎因子和趋化因子，加重肝脏炎症反应。随着NAFLD的疾病进展和肝纤维化的产生，巨噬细胞以M2型为主，在抗炎、促纤维化方面起重要作用。靶向巨噬细胞可作为NAFLD的治疗手段。例如，小分子CCR2/ CCR5拮抗剂(cenicriviroc)可抑制单核细胞来源的巨噬细胞在肝脏募集，有效改善胰岛素抵抗，减轻肝脏脂肪变性和纤维化。目前，cenicriviroc已开展Ⅱ期临床试验[16-17]。另外，小剂量糖皮质激素(地塞米松)联合抗巨噬细胞CD163抗体复合物可减轻NAFLD的肝脏炎症反应[18]。利用GR - MD - 02阻断主要表达于巨噬细胞的半乳凝素(galectin, Gal)- 3 可减缓NAFLD肝纤维化，目前已开展针对该阻断剂的Ⅱ期临床实验[19]。

研究发现，巨噬细胞源性Exos 携带的miRNAs也参与NAFLD的疾病过程。髓系特异性IL-6信号通路可特异性上调巨噬细胞源性Exos中miR-223的表达，进而抑制下游靶分子PDZ结合基序转录共激活因子(TAZ，一种促进NASH肝纤维化的重要分子)的表达，从而发挥抗纤维化作用。此研究为NASH提供了新的治疗靶点[20]。此外，NAFLD是脓毒血症的独立危险因素，并且与NAFLD患者肝细胞线粒体结构和能量代谢异常相关。巨噬细胞特异性表达髓样细胞触发受体2(TREM2)，抑制TREM2可上调巨噬细胞源性Exos中miR-106b-5p表达，进而通过阻断下游线粒体融合蛋白2(MFN2)靶分子，导致线粒体结构改变和能量代谢障碍。TREM2有望作为潜在临床治疗靶点[21]。

(三)酒精性肝病 酒精性肝病(ALD)是一种因长期大量饮酒所致的肝脏疾病。乙醇可激活KCs中NOD样受体蛋白3(NLRP3)炎症小体，释放促炎细胞因子IL-1β，并募集和活化恒定自然杀伤T(iNKT)细胞，促进肝脏炎症反应和中性粒细胞浸润[22-23]。而抑制热休克蛋白90(HSP90)和活化的热休克因子1(HSF1)可显著抑制NLRP3炎症小体活化，减少IL-1β 和 IL-18释放[24]。另有研究报道，调控基因Bmal1(Bmal1)可通过靶向钙结合蛋白A9(S100A9)负调控糖酵解途径，诱导巨噬细胞向M2极化，减缓ALD炎症反应[25]。此外，菊粉(一种自然界广泛存在的生物多糖)能调控肠道菌群产生短链脂肪酸，通过?TLR4-MyD88-NF-κB轴诱导巨噬细胞向M2极化，减轻ALD炎症反应[26]。

在ALD疾病过程中，Exos 携带的RNA也参与细胞间物质和信号传递。酒精处理的肝细胞分泌的Exos富含线粒体双链RNA(mtdsRNA)，可活化巨噬细胞TLR3，促进IL-1β和IL-17A表达。因此，mtdsRNA 和TLR3可作为ALD的治疗靶点[27]。研究还发现，ALD患者血浆Exos和ALD动物模型肝细胞和巨噬细胞源性Exos中miR-155含量显著升高，该分子可作用于下游靶分子(mTOR, Rheb，LAMP1和LAMP2)，在mTOR通路和溶酶体水平调控自噬。而LAMP1和LAMP2表达下调可显著促进Exos的产生和释放。因此，miR-155在酒精诱导的自噬损伤和Exos产生释放过程中发挥重要调节作用[28]。

(四)肝纤维化 肝纤维化是各种原因引起的肝脏反复炎症损伤后细胞外基质(ECM)过度沉积或瘢痕形成的病理结果。在慢性炎症刺激作用下，巨噬细胞通过分泌TGF-β1、血小板衍生生长因子(PDGF)等促使肝星状细胞(HSCs)活化，进而分泌ECM促进损伤修复。然而，过多的ECM累积将导致肝纤维化的发生。另一方面，巨噬细胞还可通过自身吞噬作用以及分泌基质金属蛋白酶(MMPs)、趋化因子受体CX3CR1、抗炎细胞因子等减轻肝脏炎症反应，促进活化的HSCs凋亡和ECM降解，从而抑制肝纤维化发生、发展。

巨噬细胞源性Exos可参与巨噬细胞和HSCs间信号传递，调控HSCs增殖和活化。有研究显示，脂多糖(LPS)可以诱导巨噬细胞源性Exos中富含的miRNAs发生显著改变。LPS处理的巨噬细胞源性Exos中miR-103-3p显著上调，其可通过靶向抑制Krüppel样因子(KLF)4促进HSCs的增殖和活化。临床上，肝纤维化S3-S4期患者血清Exos中miR-103-3p水平显著高于早期肝纤维化组[29]。 此外研究还显示，LPS处理的巨噬细胞源性Exos富含miR-500，其可通过下调靶分子MFN2表达，影响Smad2/Smad3磷酸化和TGF-β蛋白水平，促进肝纤维化。肝纤维化S4期患者血清中miR-500水平显著升高、MFN2水平显著降低，两者呈负相关[30]。miR-103-3p和miR-500可作为诊断肝纤维化的潜在标志物。松弛素(relaxin, RLN)与巨噬细胞表达的松弛素受体结合可诱导巨噬细胞发生表型转换，即由促纤维化表型转换为促消融表型，后者释放的Exos中含有miR-30a-5p，它可通过靶向作用于细胞凋亡信号调节激酶1(ASK1)促进HSCs中PPAR-γ上调，抑制HSCs活化，发挥抗纤维化作用。研究者还开发了一种同时装载RLN基因和miR-30a-5p模拟物的脂质纳米颗粒，并证实这种基因组合治疗能够发挥更强的抗肝纤维化作用[31]。还有研究团队开发了一种同时装载抗纤维化药物(尼达尼布)和KCs抑制剂(氯膦酸二钠)的外泌体-脂质体复合物，体内/外实验证实其可增强抗肝纤维化治疗作用，为抗肝纤维化治疗提供了新思路[32]。

(五)肝癌 2020年国际癌症研究中心发布最新数据显示，肝癌是全球第六大常见癌症，在癌症相关死亡原因中排第三位[33]。肿瘤相关巨噬细胞(TAMs)因参与肿瘤免疫微环境的调节而受到广泛关注。TAMs主要表现为M2样极化，具有促进肿瘤生长和转移作用。研究显示，TAMs可通过其分泌的Exos来发挥作用。TAMs源性Exos富含miR-92a-2-5p，该分子可靶向抑制肝癌细胞的雄激素受体(AR)表达，通过调控PHLPP/p-AKT/β-catenin信号通路增加肝癌细胞的侵袭能力[34]。M2巨噬细胞源性Exos还可通过其携带的miR-27a-3p靶向下调肝癌细胞硫氧还蛋白互作蛋白(TXNIP)表达，促进肝癌细胞的癌干性[35]。此外，在肝癌组织中发现miR-660-5p表达升高，同时KLF3表达降低。体内/外实验证实，M2巨噬细胞源性Exos携带的miR-660-5p可通过下调下游靶基因KLF3促进肝癌的进展[36]。同时，研究发现M1型巨噬细胞具有抑癌作用。M1型巨噬细胞源性Exos中携带的miR-326可通过下调NF-κB表达，抑制肝癌细胞增殖、迁移和侵袭，促进其凋亡[37]。诱导TAMs向M1型极化可抑制肿瘤的发生、发展及转移。最新研究显示，重编程M1巨噬细胞源性Exos，即转染NF-κB p50 siRNA 和miR-511-3p以及表面修饰IL4R结合蛋白，可诱导TAMs向M1极化，下调相应靶基因，减少M2细胞因子和免疫抑制细胞，从而抑制肿瘤生长，提高抗肿瘤免疫能力。该研究提供了一种新型的肿瘤免疫治疗方法[38]。

(六)肝衰竭 肝衰竭是多种因素引起的一种严重肝病症候群，导致肝脏合成、解毒、代谢和转化等功能严重障碍或失代偿，出现黄疸、凝血功能障碍、肝肾综合征、肝性脑病、腹水等临床表现，具有病因多样、临床表现复杂、病死率高、治疗难度大等特点。肝衰竭时肝细胞广泛坏死，死亡细胞释放的损伤相关分子模式(DAMPs)与巨噬细胞上的模式识别受体结合，激活炎症小体(如NLRP3)，随后诱导IL-1β、IL-6、IL-18、TNF-α、CXCL10等促炎细胞因子和趋化因子的产生，发挥促炎损伤作用。研究显示，间充质干细胞源性Exos可通过抑制NLRP3通路阻止促炎巨噬细胞的增殖和活化，减少促炎细胞因子的分泌，从而显著改善ALF[39]；还可通过激活自噬，减少肝细胞凋亡，发挥肝保护作用。此外，间充质干细胞源性Exos在促进肝脏再生方面也具有重要作用[40]。目前，关于巨噬细胞源性Exos在肝衰竭中作用机制的研究较少。有研究报道，巨噬细胞源性细胞外囊泡(EVs)高表达miR-122-5p和miR-148a-3p，通过靶向抑制下游炎症反应通路，在Con A诱导的肝损伤模型中发挥重要免疫调节作用[41]。

三、展望

巨噬细胞作为重要的先天性免疫细胞，参与多种肝病的炎症反应及免疫调节。外泌体作为结构稳定、免疫原性低、生物相容性好的天然载体，可富集和传递多种特异性生物活性物质，如蛋白质、脂质、核酸(mtdsRNA、miRNAs等)，从而发挥稳态维持、细胞间物质及信号传递、抗原提呈等重要作用，目前已逐渐成为新兴的重要非侵入性肝病检测手段和靶向药物载体。巨噬细胞和Exos均在多种肝病中具有重要作用。然而，巨噬细胞来源的Exos及其内容物在肝病(尤其肝衰竭)中的作用机制仍有待进一步研究。