LRRK2在克罗恩病中作用的研究进展

庄文涵 廖雨晗 徐鹏飞 蔡亦斐 叶月芳

炎症性肠病（IBD）是由环境因素导致遗传易感人群免疫系统紊乱和肠道微生态失调的慢性非特异性炎性疾病，包括克罗恩病（CD）和溃疡性结肠炎（UC）。目前已发现超过150个基因位点与CD发病相关，富亮氨酸重复序列激酶2（LRRK2）是相关基因之一。基因型分析表明，LRRK2基因是CD和帕金森病（PD）的共同易感基因。目前关于LRRK2与CD发病关系的研究较少，本文综述了近年来关于LRRK2在CD发病中作用的研究进展，以期为进一步探究CD的发病机制及选择诊疗方案提供新思路。

1 LRRK2的结构特点

人类LRRK2基因由51个外显子组成，其定位于染色体12q12上，可编码由2 527个氨基酸组成的多结构域蛋白——LRRK2蛋白[1-2]。LRRK2多定位于细胞膜和细胞质中的高尔基体、突触小泡、溶酶体和线粒体外膜等膜相结构上[3]；其表达广泛，存在于多种人体组织中，如脑、脾脏、胸腺和肠道等[4]；在细胞水平，LRRK2主要在小胶质细胞、巨噬细胞、树突状细胞和B细胞中表达[5]。LRRK2在细胞质中的主要存在形式是单体，而在膜相结构中则主要为二聚体；由于LRRK2二聚体的激酶活性比单体更强，故与细胞质LRRK2相比，膜LRRK2的激酶活性更强[1-2]。

LRRK2蛋白包含ARM重复序列、锚蛋白重复序列（ANK）、富含亮氨酸重复序列区（LRR）、Ras蛋白复合体（ROC）、Ras蛋白C-末端重复序列（COR）、激酶结构域（MAPKKK）和色氨酸天冬氨酸重复序列区（WD40）这7个结构域，其中ANK、LRR和WD40这3个支架结构域参与了与其他蛋白的相互作用，可维持蛋白质的构象和稳定性[6]，ROC结构域和MAPKKK结构域则分别与LRRK2的GTP酶活性和激酶活性相关，而ARM重复序列和COR结构域的功能尚未明确，ROC结构域中Y1699C和R1628P位点的突变分别与PD及麻风病相关[1-2]。LRRK2的病理、生理学研究表明，LRRK2的结构域与其多种细胞功能显著相关[7-8]，这提示LRRK2是一种作用广泛的枢纽蛋白[9]。

2 LRRK2参与CD发病的机制

2.1 LRRK2缺陷导致溶菌酶异常

潘氏细胞（PC）中的Toll样受体在直接感知肠道细菌及其代谢产物后，可激活并促进PC内抗菌颗粒如溶菌酶的形成和分泌。PC分泌的核苷酸结合寡聚化结构域蛋白2（NOD2）可通过检测共生菌的细胞壁酰二肽来感知共生菌群的存在，而共生菌群来源的信号可触发NOD2与受体相互作用蛋白2（RIP2）结合，并将LRRK2和Rab2a募集到包含溶菌酶的致密核心囊泡（DCV）上，以调控溶菌酶在DCV中的分拣[3,10]。在这一过程中，一方面LRRK2可通过调控溶菌酶影响肠道微生物的组成[11]；另一方面，共生菌群通过NOD2-LRRK2-Rab2a轴，既可在PC中引导溶菌酶分拣，也可促进共生菌群与机体的共生[10]。

细胞生命活动依赖于细胞内物质运输系统的精确传递和定向运输分泌，若囊泡运输系统的调控异常，则细胞的正常生命活动将受到影响。有研究发现，CD患者体内存在以含有溶菌酶的DCV数量减少为特征的PC囊泡转运异常现象[12]。另有研究在LRRK2－/－小鼠体内也观察到了类似现象，虽然LRRK2－/－小鼠PC中的溶菌酶mRNA表达水平正常，但由于溶菌酶都被细胞内的溶酶体降解，故其肠腔中也存在溶菌酶缺乏的情况；然而，PC内其他抗菌物质如防御素及胰岛再生源蛋白Ⅲγ（RegⅢγ）均不受LRRK2敲除的影响，这表明LRRK2在PC中可特异性调控溶菌酶的运输和分泌[3]。

由此可见，LRRK2缺陷会显著影响NOD2-LRRK2-Rab2a轴的功能，这不仅会使处于成熟过程中的DCV出现缺陷，影响溶菌酶的分拣，严重时还可导致溶菌酶异常甚至消失，以致于无法抵御病原体入侵，使机体更易受肠内外细菌感染，从而诱发 CD[3]。

2.2 LRRK2突变导致LRRK2蛋白的激酶活性异常

LRRK2蛋白的激酶活性和空间分布是由其蛋白质结构域之间的相互作用（包括自磷酸化、蛋白单体/二聚体循环、上游激酶和GTP酶的调节等）所调控的[13-14]。虽然在上述过程中，几乎所有的LRRK2结构域均能够调节激酶活性，但是只有MAPKKK结构域才是调节LRRK2蛋白的激酶活性的关键[15]。MAPKKK结构域功能获得性突变，可能导致LRRK2蛋白的激酶活性发生改变。例如LRRK2 N551K和LRRK2 R1398H突变不会改变LRRK2蛋白的激酶活性，而LRRK2 G2019S和LRRK2 N2081D突变可增强LRRK2蛋白的激酶活性[16-17]。关于PD的研究发现，多数引起PD发病的LRRK2突变位点位于MAPKKK结构域（LRRK2 G2019S）和ROC结构域（LRRK2 R1441C），这两个结构域的突变可分别使LRRK2蛋白的激酶活性增强和使ROC结构域更易与GTP结合，从而促进神经变性，导致PD发病[17]。

由于LRRK2是CD和PD共同的易感基因，而且CD相关突变位点LRRK2 N2081D和PD相关突变位点LRRK2 G2019S均位于MAPKKK结构域，两者突变均可显著上调LRRK2蛋白的激酶活性，由此推测LRRK2基因突变引起LRRK2蛋白的激酶活性发生改变后，可能通过与引发PD的相似致病通路诱导CD发病。

2.3 LRRK2突变导致活性氧过量生成

在真核生物体内，线粒体主要通过氧化磷酸化使电子在氧化呼吸链上传递并产生H+梯度，最终生成ATP，在此过程中一旦发生电子泄漏或电子传递链受损，便可能导致活性氧（ROS）形成[18-19]，其中H2O2是引起IBD肠道损伤的主要ROS[18,20-21]。

研究发现，酵母中的LRRK2可以通过调节线粒体功能和酵母的内吞作用在氧化应激过程中发挥保护细胞的作用[22]。由于多数LRRK2突变位点位于GTP酶和MAPKKK结构域等蛋白质催化核心结构域，所以LRRK2突变可通过改变酶活性从而导致线粒体融合-分裂失衡、线粒体自噬能力减弱、线粒体DNA损伤，进一步抑制过氧化物酶的活性，促进ROS生成并增高机体对H2O2的易感性[23-24]。也有研究表明，LRRK2 G2019S突变可通过打开线粒体内膜上的通透性孔，上调孔道形成蛋白的表达，上调解偶联蛋白2（UCP2）和UCP4的表达等方式，以增高线粒体内膜对质子的通透性，进而产生ROS[25]。

随着ROS水平的升高，组蛋白去乙酰化酶的活性被抑制，从而增强乙酰化激活NF-κB，导致由葡聚糖硫酸钠（DSS）诱导的结肠炎小鼠模型出现肠上皮细胞凋亡[26]。另有研究发现，ROS水平升高还会导致机体肠道干细胞增殖和异型增生的现象[27]。此外，ROS还在多种细胞因子受体的信号转导中发挥着重要作用。研究发现ROS在磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B（PI3K/Akt）信号通路中通过激活PI3K和Akt，使Akt与NF-κB抑制剂激酶α（IKKα）、一氧化氮合成酶（iNOS）、结节性硬化复合物1/2（TSC1/2）、天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-9（Caspase-9）、糖原合酶激酶 3β（GSK3β）等信号分子结合，进而引发细胞异常增殖、迁移和炎性反应，从而诱导CD的发生和发展[28]。综上所述，由LRRK2基因突变所导致的ROS过量生成也在CD发病过程中发挥着重要作用。

2.4 LRRK2异常导致自噬缺陷

自噬是一种细胞质成分在溶酶体中降解的细胞内过程，可消除机体中不需要或受损的物质，参与调节组织的发育、分化，以维持细胞稳态，还可在固有免疫和适应性免疫中发挥抵御病原体入侵的作用[29]。LRRK2参与了由NOD2介导的包含自噬过程在内的信号转导途径，在其与一种名为微管相关蛋白1轻链3（LC3）的自噬蛋白共定位后，可磷酸化衔接蛋白p62，从而发挥维持自噬平衡的作用[11]。因此无论是LRRK2基因过表达、敲除还是抑制LRRK2蛋白活性，均可诱导自噬-溶酶体途径发生改变，影响自噬平衡[30-31]。

有研究发现，在脂多糖（LPS）刺激巨噬细胞RAW264.7后，LRRK2可转位至自噬体膜上[32]。而当小鼠LRRK2基因被敲除后，LRRK2便无法转位至自噬体膜上，并且小鼠体内的次级溶酶体和自噬溶酶体样结构增大、数量增加[33]。这些物质的异常累积表明小鼠体内自噬-溶酶体清除系统受损，而且这会使得即使在正常时LRRK2表达水平较高的外周组织中也出现自噬缺陷，进而影响LRRK2维持自噬平衡的功能[34]。另有研究发现，LRRK2蛋白的激酶活性受到关键残基（主要是Ser1292和Ser935）磷酸化调控后，可影响其下游底物Rab10的磷酸化，进而发挥LRRK2调节Rab蛋白稳态的作用[15]。一旦致病性LRRK2基因（如LRRK2G2019S和LRRK2N2081D）发生突变，便可上调Rab10的磷酸化水平，使得细胞膜Rab蛋白分布异常，从而抑制自噬过程[17,35]。但有研究表明，膜相关LRRK2本身也可导致自噬级联反应的关键启动因子Beclin-1磷酸化或K48泛素化进而失活，从而导致自噬抑制[36]。由此可见，LRRK2基因的敲除、突变及膜相关LRRK2本身均可导致自噬功能受损，故调节LRRK2在维持自噬稳态方面具有重要作用。

研究发现，自噬可通过控制宿主与细菌之间的关系在维持肠上皮稳态中发挥重要作用[37]。自噬受损的肠上皮细胞会在富含TNF-α的环境中失去黏附能力，并导致肠上皮细胞损伤[38]。此外，自噬缺陷还可导致功能失调的线粒体生成，从而致使ROS生成增多，这不仅可以抑制肠道干细胞分化和上皮细胞再生，还可促进炎性小体NOD样受体蛋白3（NLRP3）的激活，促进IL-18和IL-1B的生成，加速ROS所诱导的细胞死亡[39]。另一项关于肠道纤维化的小鼠模型研究也发现，自噬刺激可预防肠道纤维化，而自噬抑制则可以加重肠道纤维化；由于肠上皮细胞损伤是CD的典型特征，肠道纤维化是CD的常见并发症，故可以认为由LRRK2异常所导致的自噬功能受损对于CD发病起着重要作用[40]。

2.5 LRRK2异常导致炎性细胞因子释放异常

CD患者的肠道多存在固有免疫显著失调。在 CD 的发病过程中，干扰素-γ（IFN-γ）、IFN-β、TNF-α和IL-6等细胞因子可诱导并上调LRRK2表达[5,41-42]。另有研究发现，LRRK2参与固有免疫中炎性细胞因子的产生和巨噬细胞趋化等过程[43-44]；LRRK2突变可在CD14+单核细胞中发挥调节固有免疫应答的作用[45-46]。因此，LRRK2表达异常可能可以加剧固有免疫失调，进而损伤组织[6]。

NOD（1/2）/RIP2信号通路是当机体应对细菌感染和内质网应激等情况时发生固有免疫应答的重要信号通路；LRRK2可通过促进Ser176位点上的RIP2磷酸化来增强RIP2活性，进而增强NOD（1/2）/RIP2信号，促进炎性细胞因子的诱导作用[47]。由于LRRK2过表达可激活小鼠固有层树突状细胞中NF-κB并促进炎性细胞因子分泌[12]，因此在DSS诱导的结肠炎小鼠模型中，LRRK2过表达组表现出比对照组（野生型小鼠）更严重的结肠炎症状[36]。而使用LRRK2抑制剂后，则可通过抑制LPS诱导的LRRK2蛋白的激酶活性，减少LPS诱导的TNF受体相关因子6（TRAF6）与LRRK2相互作用，以及抑制MAPK和NF-κB抑制蛋白α（IkBα）磷酸化，从而减少CD患者树突状细胞中炎性细胞因子TNF-α的产生，起到抗炎作用，进而改善DSS诱导的结肠炎症状[48]。此外，在对巨噬细胞的研究中也发现了类似现象，即当胞壁酰二肽激活NOD2、γ-D-谷氨酸-内消旋-二氨基庚二酸（iE-DAP）激活NOD1或内质网应激时，LRRK2缺陷可以显著抑制巨噬细胞分泌炎性细胞因子[47]。由此可见，LRRK2可正向调节炎性细胞因子的分泌[39]。

然而，也有研究发现LRRK2具有相反的调节效应，活化T细胞核因子（NFAT）是免疫应答中的重要介质[49]，而LRRK2是NFAT抑制因子NRON复合体的主要组成部分。正常情况下，LRRK2可在细胞质中形成NRON复合物捕获NFAT，从而将NFAT隔离在细胞质中[50]。但在 LRRK2－/－小鼠的细胞质中，LRRK2缺乏会使NFAT在细胞质中隔离失败，进而使其向细胞核移位并诱导炎性细胞因子的转录[51-52]，增加炎性细胞因子数量，提高对DSS诱发结肠炎的易感性并加重结肠炎症状[50,53]。这表明LRRK2也可通过将NFAT隔离在细胞质中发挥负向调控炎性介质和细胞因子分泌的作用[2]。

综上所述，由于LRRK2基因无论是过表达还是敲除均可通过不同的通路调控炎性细胞因子的分泌，进而提高机体对CD的易感性，故调节LRRK2的表达对于防治结肠炎具有重要的意义[54]。

3 总结与展望

LRRK2的异常改变（如LRRK2基因过表达、敲除、突变或LRRK2蛋白活性受到抑制）可通过影响PC内溶菌酶的分泌、LRRK2蛋白的激酶活性、ROS的释放、自噬过程及炎性细胞因子的释放等导致CD发病。LRRK2在CD病程中所起的作用是复杂且广泛的，虽然其在一定程度上可以为CD的诊断和治疗提供依据，但是由于在LRRK2异常的CD患者中，LRRK2的致病机制可能存在个体间差异，而且各机制之间存在高度相关性，因此对CD患者开展靶向LRRK2单一致病机制的治疗的效果并不显著。考虑到CD发病机制的复杂性，LRRK2调节剂与常规药物的联合治疗方案可能可以更好地控制CD病情。为了进一步优化治疗方案，开发特异度和安全性较高、疗效较显著的调节剂，可在目前已取得的LRRK2相关研究成果的基础上，继续深入探索LRRK2的发病机制。