幽门螺杆菌感染与胃癌组织Her-2、CyclinD1、miR-223的相关性及对肿瘤侵袭性的影响

陈进强,马佳红

陈进强,嘉兴市第一医院检验科 浙江省嘉兴市 314000

马佳红,浙江省荣军医院检验科 浙江省嘉兴市 314031

0 引言

胃癌是常见消化系统恶性肿瘤,仍是我国第3大常见恶性肿瘤,第2大致死性恶性肿瘤,是危害国人健康的重大疾病之一[1,2].胃癌的早期诊断与及时治疗是改善预后的关键因素.人表皮生长因子受体2(human epidermal growth factor receptor 2,Her-2)是人表皮生长因子受体家族成员,细胞周期蛋白D1(CyclinD1)是调控细胞周期的重要蛋白,研究表明,二者在胃癌组织中表达异常升高[3,4].恶性肿瘤发生发展过程中,伴随着多种微小RNA(miRNA)异常表达,其中miR-223发挥着癌基因的作用[5].幽门螺旋杆菌(Helicobacter pylori,H.pylori)感染是诱发胃癌的最重要环境因素之一[6].研究发现[7,8],H.pylori与Her-2、CyclinD1、miR-223在胃癌发生、发展中发挥交互作用.基于此,本研究首次探讨H.pylori感染与胃癌组织Her-2、CyclinD1、miR-223的相关性及对肿瘤侵袭性的影响,为揭示胃癌发生机制提供参考.报道如下.

1 材料和方法

1.1 材料 选取2018-06/2020-06我院54例胃癌患者作为研究对象,另取距离肿瘤5 cm以上的癌旁组织作为对照组.纳入标准: 均经病理学明确诊断为胃癌;活检前或术前均未接受放化疗及免疫治疗;患者签署知情同意书.排除标准: 合并其他恶性肿瘤;长期口服糖皮质激素、非甾体类消炎药.年龄: ＜60岁24例,≥60岁30例;性别: 男34例,女20例;肿瘤大小: ≤5 cm,32例,＞5 cm,22例;TNM分期: Ⅰ期9例,Ⅱ期13例,Ⅲ期20例,Ⅳ期12例;肿瘤位置贲门、胃底15例,胃体12例,胃窦27例.本研究符合医学伦理学标准,经医院伦理委员会批准(批号:QY2368).

1.2 方法 (1)胃癌组织及癌旁组织m i R-223表达:Invitrogen公司组织总RNA提取试剂Trizol,TaKaRa公司反转录酶,上海工硕生物技术有限公司实时定量聚合酶链式反应(PCR)的2×SYBR Green Master Mix.利用Trizol试剂提取组织总RNA,反转录酶的作用下合成cDNA,按2×SYBR Green Master Mix要求行实时定量PCR反应,在Bio-Rad实时定量PCR仪上进行,反应条件: 95 ℃ 30 s,紧接着40 个循环(95 ℃ 30 s,56 ℃ 30 s,72℃ 30 s),以U6 RNA为内参检测miR-223表达水平.其中引物序列为F:5’-GCCGGCGCCCGAGCTCTGGCTC-3’,R:5’-TGTCAGTTTGTCAAATACCCCA-3’.内参为U6: F:5’-GTGCTCGCTTCGGCAGCACAT-3’,R:5’-TACCTTGCGAAGTGCTTAAAC-3’;(2)胃癌组织及癌旁组织Her-2、CyclinD1表达: 英国Abcam公司兔抗人Her-2抗体,北京中杉金桥生物技术有限公司兔抗人CyclinD1单克隆抗体.免疫组织化学染色sp方法检测胃癌组织、癌旁组织Her-2、CyclinD1表达,实施染色,阳性对照: 已知Her-2、CyclinD1染色阳性的胃癌组织,阴性对照: 磷酸缓冲盐溶液(phosphate-buffered saline,PBS)代替一抗.观察切片,每张切片随机选取5个(×400倍)高倍视野,均计数100个细胞.参照《胃癌HER2检测指南(2016版)》[9]判断HER2结果: HER2阳性表达为细胞膜出现棕黄色颗粒,随机选取5个视野(×200倍),均计数100个细胞,细胞膜均无着色或≤10%呈淡黄色为(-);＞10%细胞的细胞膜呈淡黄色或有隐约可见的膜染色,未包绕细胞膜,染色间断为(+);＞10%细胞的细胞膜呈黄色或棕黄色,包绕细胞膜,染色连续为(2+);＞10%细胞的细胞膜呈深棕色,包绕细胞膜,染色连续为(3+).CyclinD1: 着色强度: 无着色、淡黄色、棕黄色、棕褐色分别为0分、1分、2分、3分;阳性细胞数范围: ＜5%、5%-25%、26%-50%、51-75%、＞75%分别为0分、1分、2分、3分、4分;两项结果相加＜2分为阴性,＞2分为阳性;(3)H.pylori感染判定:胃粘膜组织快速尿素酶试验、组织切片染色、H.pylori培养3项中任意一项显示阳性.14C尿素呼气试验结果显示阳性.

1.3 观察指标 (1)胃癌组织及癌旁组织Her-2、CyclinD1、miR-223表达;(2)H.pylori感染与未感染胃癌患者临床资料;(3)H.pylori感染与未感染患者胃癌组织侵袭基因、Her-2、CyclinD1、miR-223表达;(4)胃癌组织Her-2、CyclinD1、miR-223表达、浸润深度、淋巴结转移与H.pylori感染的关系;(5)不同病理特征胃癌H.pylori感染患者Her-2、CyclinD1、miR-223表达.

统计学处理采用统计学软件SPSS 22.0处理数据,计数资料以例数描述,χ2检验,计量资料采取Bartlett方差齐性检验与Kolmogorov-Smirnov正态性检验,均确认具备方差齐性且近似服从正态布,以(mean±SD)描述,行t检验;影响因素采用Logistic回归分析;双变量正态分布采用Pearson分析相关性.均采用双侧检验,P＜0.05为差异有统计学意义.

2 结果

2.1 胃癌组织及癌旁组织Her-2、CyclinD1、miR-223表达 胃癌组织Her-2、CyclinD1、miR-223表达量高于癌旁正常组织,差异有统计学意义(P＜0.05).见表1、图1-3.

图1 胃癌患者Her-2表达.A: 癌组织Her-2;B: 癌旁正常组织Her-2.Her-2: 为人表皮生长因子受体2.

表1 胃癌组织及癌旁组织Her-2、CyclinD1、miR-223表达量对比(mean±SD)

2.2 不同病理特征胃癌H.pylori感染患者Her-2、CyclinD1、miR-223表达 胃癌H.pylori感染患者Her-2、CyclinD1、miR-223表达与分化程度、浸润深度、TNM分期、淋巴结转移有关(P＜0.05).见表2.

表2 不同病理特征胃癌H.pylori感染患者Her-2、CyclinD1、miR-223表达对比(mean±SD)

2.3H.pylori感染与未感染患者临床资料H.pylori感染与未感染胃癌患者浸润深度、淋巴结转移相比,差异有统计学意义(P＜0.05).见表3.

表3 H.pylori感染与未感染胃癌患者临床资料对比

2.4H.pylori感染与未感染患者胃癌组织Her-2、CyclinD1、miR-223表达H.pylori感染与未感染患者胃癌组织Her-2、CyclinD1、miR-223表达相比,差异有统计学意义(P＜0.05).见表4.

2.5 Logistic回归分析 分析可知,胃癌组织Her-2、CyclinD1、miR-223表达、浸润深度、淋巴结转移与H.pylori感染有关(P＜0.05).见表4.

表4 H.pylori感染与未感染患者胃癌组织Her-2、CyclinD1、miR-223表达(mean±SD)

3 讨论

目前,胃癌确切机制尚不清楚,深入研究胃癌病因及发病机理仍是胃癌基础研究的重中之重.临床研究已证实,H.pylori感染是引发胃粘膜不典型增生、慢性萎缩性胃炎、胃溃疡等癌前病变的重要因素,也是胃癌重要危险因素[10].世界卫生组织国际癌症研究机构已经将H.pylori列为Ⅰ类致癌因素[11].研究认为,H.pylori致病性主要依赖脂多糖(lipopolysaccharides,LPS)、CagA等毒力因子,LPS、CagA通过与宿主发生相互作用,引起胃粘膜持续慢性炎症,诱导胃癌发生、发展;并上调Toll样受体4表达,促进胃癌细胞增殖;也可通过减弱γ干扰素介导的细胞免疫及单核细胞介导的抗肿瘤活性,促进胃癌进展[12,13].但详细致癌机制尚不清楚.本研究数据显示,胃癌患者浸润深度、淋巴结转移与H.pylori感染有关,提示H.pylori感染参与胃癌浸润、转移过程,这与既往研究结果[14]类似,又不完全相同,可能与研究样本量、病例分期等不同有关.

Her-2属原癌基因,定位在染色体17q12,编码产物为Ⅰ型跨膜生长因子受体酪氨酸激酶,可影响细胞生长、生存、分化及凋亡.研究发现,乳腺癌、食管癌、胃癌等恶性肿瘤组织均检测出Her-2过表达[15].细胞周期紊乱是肿瘤形成的决定因素之一.CyclinD1是细胞周期重要调节蛋白,可促进细胞周期由G1期进入S期.正常情况下,细胞进入S期后,cyclinD1迅速分解,若cyclinD1持续高表达,可导致细胞提前进入S期,出现增殖失控、紊乱,促进恶性肿瘤的发生、发展.本研究数据显示,胃癌组织Her-2、CyclinD1表达量高于癌旁正常组织,差异有统计学意义(P＜0.05),提示Her-2、CyclinD1表达均与胃癌发生有关,与既往研究[16,17]一致.恶性肿瘤发生发展过程中,存在多种miRNA异常表达.研究报道,定位于肿瘤脆弱区域或肿瘤相关区域的miRNA达50%,扮演着原癌或抑癌基因的角色.miR-223作为miRNA众多与肿瘤相关家族中的一员,涉及细胞增殖、分化、凋亡等多种生物学功能,与肿瘤形成及发展直接相关[18].体外研究显示[19],H.pylori感染可诱导AGS、GES-1胃癌细胞株的miR-223表达,且进一步研究显示,miR-223模拟物转染不仅可以促进AGS胃癌细胞生长、促进其克隆形成,还可以提高胃癌细胞的迁移和侵袭能力.本研究数据显示,胃癌组织miR-223表达量高于癌旁正常组织,提示胃癌中miR-223可能发挥癌基因的作用.

图2 胃癌患者CyclinD1表达.A: 癌组织CyclinD1;B: 癌旁正常组织CyclinD1.CyclinD1: 细胞周期蛋白D1.

为明确胃癌患者与H.pylori感染与胃癌组织Her-2、CyclinD1、miR-223表达的关系,进一步深入了解胃癌发生机制,本研究创新性探讨发现,H.pylori感染患者胃癌组织Her-2、CyclinD1、miR-223表达升高,且与H.pylori感染有关.推测H.pylori自身及其代谢产物具有潜在致癌活性,可能引起Her-2、CyclinD1、miR-223扩增、激活,促进胃癌浸润、转移过程.但详细机制仍有待后续研究一步证实.进一步分析发现,胃癌H.pylori感染患者Her-2、CyclinD1、miR-223表达与分化程度、浸润深度、TNM分期、淋巴结转移有关.分析机制可能为,HER-2过度表达,通过上调血管内皮生长因子表达,促进肿瘤新生血管生成,参与肿瘤进展[20];CyclinD1是细胞周期调控机制中的重要基因,可促进细胞增殖[21];miR-223可通过调控PI3K/AKT通路、JAK2/STAT3通路等,增强胃癌细胞侵袭、转移能力,抑制胃癌细胞凋亡[22].Her-2、CyclinD1、miR-223亦可能通过与H.pylori相互影响,共同促进胃癌进展.

表5 Logistic回归分析

图3 癌组织患者miR-223表达.A: 癌组织miR-223;B: 癌旁正常组织miR-223.miR-223: 微小RNA-223.

4 结论

综上可知,H.pylori感染可能通过影响胃癌组织Her-2、CyclinD1、miR-223表达而对肿瘤侵袭性产生影响.本研究可能为胃癌及其转移患者的诊断与治疗提供新思路.

文章亮点

实验背景

胃癌是常见消化系统恶性肿瘤,仍是我国第3大常见恶性肿瘤,第2大致死性恶性肿瘤.胃癌的早期诊断与及时治疗是改善预后的关键因素.幽门螺旋杆菌(Helicobacter pylori,H.pylori)感染是胃癌发生的因素之一,但详细致癌机制尚不清楚,人表皮生长因子受体2(human epidermal growth factor receptor 2,Her-2)、细胞周期蛋白D1(CyclinD1)、微小RNA-223(miR-223)、发展中也具有重要作用,猜想H.pylori感染可能影响Her-2、CyclinD1、miR-223从而影响病情进展.

实验动机

本研究首次探讨H.pylori感染与胃癌组织Her-2、CyclinD1、miR-223的相关性及对肿瘤侵袭性的影响,为揭示胃癌发生机制提供参考.

实验目标

探讨H.pylori感染与胃癌组织Her-2、CyclinD1、miR-223的相关性及对肿瘤侵袭性的影响.

实验方法

选取2018-06/2020-06我院54例胃癌患者作为研究对象,另取距离肿瘤5 cm以上的癌旁组织作为对照组.对比胃癌组织及癌旁组织Her-2、CyclinD1、miR-223表达,采用Pearson相关性分析H.pylori感染与未感染患者临床资料、Her-2、CyclinD1、miR-223表达的相关性,采用Logistic回归分析胃癌H.pylori感染的影响因素.

实验结果

胃癌组织Her-2、CyclinD1、miR-223表达量高于癌旁正常组织;H.pylori感染与胃癌组织Her-2、CyclinD1、miR-223具有显著相关性及对肿瘤侵袭性产生影响,揭示了胃癌发生机制,设计合理,数据详实.

实验结论

H.pylori自身及其代谢产物具有潜在致癌活性,可能引起Her-2、CyclinD1、miR-223扩增、激活,促进胃癌浸润、转移过程.且胃癌H.pylori感染患者Her-2、CyclinD1、miR-223表达与分化程度、浸润深度、TNM分期、淋巴结转移有关;Her-2、CyclinD1、miR-223亦可能通过与H.pylori相互影响,共同促进胃癌进展.

展望前景

本研究通过肿瘤新生血管生成、细胞周期调控基因和信号通路探讨了胃癌进展的作用机制,设计合理,数据详实,切合实际,值得推广继承和研究.对临床具有指导意义,可为胃癌及其转移患者的诊断与治疗提供新思路.