单核细胞趋化蛋白-1、高迁移率族蛋白-1联合外周血铁蛋白在诊断和评估药物性肝损伤中的价值

鲁欢乐,倪红妙,张宇东,刘 媛

鲁欢乐,倪红妙,张宇东,刘媛,杭州市第九人民医院重症医学检验科 浙江省杭州市 330112

0 引言

药物性肝损伤(drug-induced liver injury,DILI)是由各种药物及其代谢产物诱发的肝损伤,是最常见和最严重的一种药物不良反应,可导致急性肝衰竭,甚至死亡,迄今仍缺乏特效治疗手段,因此研究客观、特异、简便诊断和病情评估方法意义重大[1].现阶段DILI的诊断常依据患者用药史、肝功能检测、临床症状体征、肝组织活检等,存在流程繁琐、特异性低、有一定创伤等缺点,在DILI患者初步筛查中应用受限,故有必要研究便捷性的诊断方法.血清铁蛋白(serum ferritin,SF)是评估机体铁储存量的有效指标,根据既往资料[2],SF在肝损伤患者中水平高于无肝损伤者.单核细胞趋化蛋白-1(monocyte chemotactic protein-1,MCP-1)在放射性肝损伤小鼠中水平升高,可反映小鼠肝损伤情况[3].高迁移率族蛋白-1(high mobility group protein-1,HMGB1)在利福平致肝损伤小鼠中水平升高,阻断HMGB1可通过抑制HMGB1-内质网应激途径减轻利福平导致的小鼠肝损伤[4].故推测SF、MCP-1、HMGB1可能与DILI有关,并有助于DILI的诊断,但现阶段关于这方面的临床报道鲜见,基于此本研究对此进行探讨,旨在为临床诊治DILI提供参考,报告如下.

1 材料和方法

1.1 材料 选取2018-01/2021-02我院收治的184例DILI患者作为研究对象进行前瞻性研究,其中154例可明确用药名称,30例未能明确具体用药.导致DILI的药物种类有中草药32例(主要有蜂胶糖脂舒软胶囊、维C银翘片、雷公藤多甙片、小柴胡),保健品类66例(主要有健脑类、益肾类等),解热镇痛消炎药30例(主要有对乙酰氨基酚、安乃近、布洛芬、别嘌醇),抗生素22例(主要有阿奇霉素、头孢类抗菌素、克林霉素),抗肿瘤药4例(环磷酰胺),除保健品类40例患者说明存在过量服用外,剩余患者均主诉遵医嘱或售卖商家建议的剂量用药,未过量用药.纳入标准: (1)DILI的诊断参考《药物性肝损伤诊治指南》[5]中标准(见图1);(2)首次确诊;(3)入组前无相关治疗史;(4)年龄≥18岁.排除标准: (1)肝癌患者;(2)用药前肝功能异常者;(3)用药前有病毒性肝炎、自身免疫性肝炎者.并选取同期酒精性肝病(16例)、非酒精性脂肪肝病(54例)患者70例作为非DILI肝病组以及体检中心70例健康人群作为对照组.本研究获医院伦理委员会审核通过,患者及家属充分知情,自愿加入,并签署书面知情同意书.

图1 患者入组流程图.DILI: 药物性肝损伤;ALT: 谷丙转氨酶;AST: 谷草转氨酶;TBIL: 总胆红素;ALP: 碱性磷酸酶;RUCAM: Roussel Uclaf因果关系评价表.

1.2 方法

1.2.1 DILI严重程度分级: 参考《药物性肝损伤诊治指南》[5]将DILI严重程度分为0-5级,其中1级为轻度患者(轻度组),2级为中度患者(中度组),3级为重度患者(重度组).

1.2.2 检测方法: DILI患者在治疗前、治疗后,对照组在入院后清晨采集空腹肘部静脉血5 mL,应用酶联免疫吸附法检测SF、MCP-1、HMGB1水平,SF试剂盒购于天津洁瑞医学生物工程有限公司,MCP-1试剂盒购于上海瑞番生物科技有限公司,HMGB1试剂盒购于深圳市科润达生物工程有限公司;采用全自动生化分析仪(美国贝克曼DXC800)检测丙氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase,ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(aspartate aminotransferase,AST)、总胆红素(total bilirubin,TBIL)、碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)水平;采用血凝仪检测凝血酶原时间,计算国际标准化比值(international normalized ratio,INR).

1.2.3 治疗方法及转归: 《药物性肝损伤诊治指南》[5],停用可疑肝损伤药物,避免再次使用同类药物,并权衡停药后对肝损伤加重的风险,根据DILI的类型选取药物治疗,重症患者必要时考虑肝移植.本研究中,轻度和中度患者经对应治疗后,肝功能逐渐恢复正常,重度患者中5例接受肝移植后无病死发生,肝功能逐渐改善,14例经综合评估后,在患者充分知情前提下,给予药物治疗,肝功能明显改善.

1.3 观察指标 (1)比较各组一般资料;(2)比较各组SF、MCP-1、HMGB1水平.(3)分析SF、MCP-1、HMGB1与ALT、AST、TBIL、ALP关系;(4)分析各指标与DILI严重程度关系;(5)分析DILI严重程度的相关影响因素;(6)各指标及联合诊断DILI的价值.

统计学处理采用SPSS 22.0处理数据,样本量的选取依据多个样本均数比较所需样本含量计算方法,利用SPSS 22.0软件计算得出,计量资料符合正态分布的以mean±SD表示,多组间比较以单因素方差分析,两两比较以LSD-t检验,组间以独立样本t检验,计数资料用n(%)表示,行χ2检验,应用Pearson分析SF、MCP-1、HMGB1与ALT、AST、TBIL、ALP关系,应用Spearman分析SF、MCP-1、HMGB1与DILI严重程度关系,采用多分类Logistic回归方程分析DILI严重程度的相关影响因素,应用受试者工作特征曲线(receiver operating characteristic,ROC)及ROC下面积(area under the curve,AUC)分析SF、MCP-1、HMGB1及联合诊断DILI的价值.P＜0.05为差异有统计学意义.

2 结果

2.1 各组一般资料比较 各组年龄、性别、饮酒史、吸烟史、体质量指数、慢性病史、DILI分型比较,差异无统计学意义;ALT、AST、TBIL、ALP、INR: 重度组＞中度组＞轻度组和非DILI肝病组＞对照组(P＜0.05).见表1.

表1 各组一般资料比较

2.2 各组SF、MCP-1、HMGB1比较 治疗前SF、MCP-1、HMGB1: 重度组＞中度组＞轻度组＞非DILI肝病组＞对照组,两两比较差异均有统计学意义(P＜0.05);重度组、中度组、轻度组治疗后SF、MCP-1、HMGB1均低于治疗前(P＜0.05).见表2.

表2 各组SF、MCP-1、HMGB1比较(mean±SD)

2.3 SF、MCP-1、HMGB1与肝功能指标关系 以DILI患者治疗前各指标为源数据,应用Pearson进行相关性分析,结果显示,SF、MCP-1、HMGB1与ALT(r=0.895、0.768、0.863,P均＜0.001)、AST(r=0.804、0.804、0.866,P均＜0.001)、TBIL(r=0.789、0.794、0.752,P均＜0.001)、ALP(r=0.812、0.722、0.834,P均＜0.001)呈正相关(P＜0.05).

2.4 SF、MCP-1、HMGB1与DILI严重程度关系 以DILI患者治疗前各指标为源数据,应用Spearman进行相关性分析,结果显示,治疗前SF(r=0.665,P＜0.001)、MCP-1(r=0.693,P＜0.001)、HMGB1(r=0.728,P＜0.001)与DILI严重程度正相关.见图2.

图2 SF、MCP-1、HMGB1与DILI严重程度关系.SF: 铁蛋白;MCP-1: 单核细胞趋化蛋白-1;HMGB1: 高迁移率族蛋白-1;DILI: 药物性肝损伤.

2.5 多分类Logistic回归方程分析 以DILI严重程度为因变量(轻度、中度、重度依次赋值1、2、3),纳入各组比较P＜0.05的指标作为自变量(SF、MCP-1、HMGB1低水平赋值1,高水平赋值2),应用多分类Logistic回归方程分析,结果显示,将ALT、AST、TBIL、ALP、INR控制后,治疗前SF、MCP-1、HMGB1仍是DILI病情程度的相关影响因素(P＜0.05).见表3.

表3 多分类Logistic回归方程分析

2.6 SF、MCP-1、HMGB1诊断价值 以DILI患者治疗前各指标为阳性样本,以对照组为阴性样本,绘制各指标的ROC曲线,并应用Logistic二元回归拟合构建各指标联合的ROC诊断模型,结果显示,治疗前SF、MCP-1联合HMGB1诊断DILI及鉴别重度DILI的AUC最大,见图3和4、表4.

表4 ROC分析结果

图3 SF、MCP-1、HMGB1诊断DILI价值.SF: 铁蛋白;MCP-1: 单核细胞趋化蛋白-1;HMGB1: 高迁移率族蛋白-1;DILI: 药物性肝损伤.

3 讨论

ALT、AST、TBIL、ALP是传统肝功能指标,发生肝损伤时,其活性可明显升高,因此被视为诊断DILI的常用参考指标.但由于ALT、AST、TBIL、ALP亦可能在进行性肌营养不良、心肌梗死等疾病中升高,并易受饮食、睡眠等因素影响,导致诊断特异性不足,临床应用受限,所以研究新的诊断标志物是必要的[6].本研究显示,SF、MCP-1、HMGB1与ALT、AST、TBIL、ALP呈正相关,表明SF、MCP-1、HMGB1与传统肝功能指标变化趋势一致,可能在评估DILI中的具有一定实际.

其中SF是机体储存铁的一种形式,常由肝细胞合成,之后储存于肝实质细胞的胞浆中,生理状态下,血清中含量较少.既往研究显示[7,8],铁过载是肝移植患者肝脏缺血再灌注损伤的相关危险因素,并能区分肺炎患者是否发生肝损伤.本研究显示,DILI患者SF较健康体检者升高,且随着DILI严重程度加重,逐渐升高,与刘萍萍等[9]报道相似,证实SF与DILI的发生及严重程度有关.DILI患者存在肝细胞炎性反应,激活巨噬细胞后,增加了SF合成,且肝细胞碎屑性坏死、变性坏死等,可使胞浆中SF释放入血,从而引起外周血SF水平升高.当SF＞169.21 μg/L,诊断SF的AUC为0.870,敏感度为80.43%,特异度为88.57%,呈现出较高的诊断效能,能为临床诊断DILI提供客观参考依据.由于DILI患者SF越高,病情程度越严重,故临床应加强对高水平患者病情评估、监测及干预,避免发生急性肝衰竭、死亡,以改善患者预后.

MCP-1是一种趋化因子,由内皮细胞、成骨细胞、平滑肌细胞等分泌,可作用于单核细胞和巨噬细胞[10,11].本研究显示,与健康体检人群相比,DILI患者MCP-1较高,提示MCP-1与DILI有关,且MCP-1越高,DILI越严重.Li等[12]报道,肝细胞损伤时,MCP-1水平升高,且MCP-1可介导炎症反应的扩大,采用一定措施抑制MCP-1合成和释放,则能减轻急性肝衰竭病情.敲除MCP-1趋化性细胞因子受体2后,可保护肝细胞免受氧化应激、炎症反应的损伤[13].佐证了MCP-1在肝损伤中所起的作用.MCP-1结合趋化性细胞因子受体2后,具有吸附单核细胞移动的功能,并能调控血管内皮细胞黏附分子表达,使激活的单核/巨噬细胞在肝损伤部位聚集,引起肝细胞的炎症损伤,MCP-1水平越高,肝炎性损伤越严重,因此与DILI患者病情程度有关[14].当MCP-1＞246.82 pg/mL时,诊断DILI的AUC为0.803,敏感度为59.78%,97.14%,呈现出一定诊断价值,可为临床提供参考信息.

图4 SF、MCP-1、HMGB1鉴别不同病情DILI价值.SF: 铁蛋白;MCP-1: 单核细胞趋化蛋白-1;HMGB1: 高迁移率族蛋白-1;DILI: 药物性肝损伤.

HMGB1广泛存在于细胞质、细胞外、细胞核,不同位置发挥不同的生物学功能,在细胞坏死时可被动释放至外周循环,免疫细胞活化时可主动分泌至外周循环,因此外周血中HMGB1是细胞炎症和坏死的指标[15].本研究显示,DILI患者HMGB1高于对照组,且HMGB1与DILI严重程度呈正相关,表明HMGB1有助于DILI的诊断和病情程度的评估.Starkey Lewis等[16]研究显示,乙酰氨基酚用药过量后,可导致急性肝损伤,并伴有HMGB1水平的升高,本研究观点与之相似.HMGB1参与DILI的机制可能有: (1)HMGB1能趋化中性粒细胞向炎症部位的聚集,扩大炎性反应,介导肝细胞的损害、凋亡;(2)HMGB1肽链上包含3个对氧化还原反应敏感的半胱氨酸残基,可介导氧化反应,引起肝细胞的氧化应激损伤[17,18].当HMGB1＞3.83 ng/mL,诊断DILI的AUC为0.859,敏感度为72.83%,特异度为88.57%,能为临床诊断提供量化的数据参考.

另SF、MCP-1联合HMGB1诊断DILI的AUC最大,故建议临床联合检测三者对DILI进行诊断,以提高诊断准确性.其原因可能是,SF、MCP-1联合HMGB1涵盖了DILI发生的更多机制,所以联合应用时诊断价值更高.同时三者联合鉴别重度DILI的AUC亦最大,提示联合检测三者能提高对重度DILI的鉴别价值,从而为临床诊治提供可靠的参考.本研究不足之处在于,DILI包括肝细胞型、胆汁淤积型、混合型,不同类型的DILI患者,三个指标间有无差异本研究未进行统计分析尚不明确,亦需后续进行分类比较进行证实.

4 结论

综上,外周血SF、MCP-1、HMGB1与DILI及其严重程度有关,在DILI诊断及病情评估呈现出较高应用价值,可作为诊断和评估DILI病情程度的生物标志物,为临床提供参考信息.

文章亮点

实验背景

现阶段全球上市药物中有＞1100种药物具有潜在肝毒性,使药物性肝损伤(drug-induced liver injury,DILI)的病因、机制、诊断和治疗在全球越来越受到重视,但由于其诱因较多,发病机制复杂等,导致临床快速诊断困难.

实验动机

当前DILI仍无特效治疗手段,并缺乏客观、特异、便捷的诊断指标和病情标志物,本研究旨在为DILI的初步筛查诊断和病情评估提供一种便捷方法,为临床诊治DILI提供客观参考依据.

实验目标

本研究主要探讨血清铁蛋白(serum ferritin,SF)、单核细胞趋化蛋白-1(monocyte chemotactic protein-1,MCP-1)、高迁移率族蛋白-1(high mobility group protein-1,HMGB1)与DILI严重程度的关系及三者联合应用的诊断价值,为DLILI初步的无创筛查诊断和肝损伤程度的快速评估提供参考.

实验方法

本研究采用前瞻性研究方法,可减少数据的偏倚,并运用皮尔森(Pearson)/斯皮尔曼(Spearman)进行相关性分析,说明SF、MCP-1、HMGB1与病情程度关系,同时多分类Logistic回归方程能阐明SF、MCP-1、HMGB1对DILI严重程度的独立影响效应和标志物的潜质,且本研究首次采用受试者工作特征曲线(receiver operating characteristic,ROC)分析获取的各诊断参数能为临床提供量化的诊断参考.

实验结果

本研究发现SF、MCP-1、HMGB1在DILI中表达明显异常,并随着DILI严重程度加重逐渐递增,校正了各混杂因素后,三者仍是DILI病情程度的相关影响因素,可作为诊断及病情评估的指标.

实验结论

DILI的快速、无创、准确诊断迄今仍是消化内科的难点和棘手问题,本研究创新性发现了外周血SF、MCP-1、HMGB1可作为DILI的生物标志物,在DILI的诊断与病情评估中呈现出巨大的潜在应用前景.

展望前景

本研究设置非DILI肝病组和健康人群作为对照,通过庞大的数据统计分析,体现SF、MCP-1、HMGB1在DILI中的敏感性和特异性,但纳入样本量较少,下一步仍需积累更多的病例,进行进一步的验证.