HB&L微生物培养系统用于脑脊液快速培养鉴定及药敏试验的方法研究

董 蓉，张 静，丁赔赔，张 泽，李艳君

解放军总医院第六医学中心 检验科，北京 100048

颅内感染是指病原微生物侵犯脑实质、包膜和血管引起感染性炎症，是颅内术后严重并发症之一，治疗难度大，致死率较高[1-2]。目前大多数实验室病原学检查方法是将脑脊液标本注入血培养瓶中进行增菌培养，培养阳性后再转种固体培养基进行分离培养，经过12 ～ 24 h后获得单个菌落，再进行后续的菌种鉴定和药敏试验，整个过程一般需要72 h。基于此，学者们尝试把脑脊液阳性标本用分离胶促凝管离心，洗涤或用试剂处理，以富集蛋白直接质谱鉴定菌种[3-5]。但这些操作过程比较烦琐，鉴定准确率不够理想，故寻找一种省时且准确率高的检测方法，对临床治疗十分重要。HB&L微生物培养系统(以下简称HB&L系统)是意大利Alifax公司研发，于1991年在国外上市应用，最初用于尿液病原菌快速筛查，通过在培养肉汤中添加营养物质，辅以磁棒搅拌能够促进细菌的快速繁殖，采用激光散射技术实时监测细菌生长情况，大大缩短培养时间。随着技术不断改进，HB&L系统在其他方面也得到应用，如尿液、血液、关节液、透析液等，甚至耐药表型检测[6-12]。本研究对脑脊液阳性标本进行HB&L系统快速培养，并进行后续基于MALDITOF MS的菌种鉴定和VITEK-2 Compact的药敏试验，以常规法结果为金标准，探讨HB&L系统快速培养鉴定和药敏试验的可行性。

材料与方法

1 标本来源 收集我中心2021年1月- 2022年1月应用血培养瓶进行脑脊液培养的阳性标本(镜检为单一形态细菌)37例，同一患者仅纳入1次。

2 主要仪器和试剂 哥伦比亚血平板、麦康凯平板、不加万古霉素巧克力平板、需氧和厌氧血培养瓶均购自郑州安图生物公司；Bact/Alert 3D全自动微生物检测培养系统、VITEK-2 Compact全自动生化鉴定和药敏仪器、AST-GP67、AST-N335、AST-GN09药敏卡片、酵母样真菌药敏试剂盒ATB FUNGUS 3均购自法国梅里埃公司；HB&L微生物培养系统及配套体液增菌瓶均购自意大利Alifax公司；MALDI-TOF MS鉴定仪及配套基质液购自德国布鲁克公司。质控菌株：大肠埃希菌ATCC25922、粪肠球菌ATCC29212、白色假丝酵母菌ATCC6258均购自中国普通微生物菌种保藏管理中心。

3 镜检 Bact/Alert 3D血培养仪阳性报警后，用一次性注射器抽出1 mL 脑脊液阳性培养液，取1 ～ 2滴涂片并行革兰染色，镜检为单一形态细菌纳入本研究，进行后续试验。

4 常规培养法 将脑脊液阳性培养液以三区划线方式接种于哥伦比亚血平板、麦康凯平板和不加万古霉素的巧克力平板，置于5% CO2、35℃培养箱中孵育18 ～ 24 h后，挑取单个纯菌落，均匀涂布于质谱仪靶板上，晾干，加1 µL 70%甲酸，晾干，加1 µL基质液，晾干，上机进行菌种鉴定，用VITEK-2 Compact仪器进行药敏试验，并记录鉴定和药敏检测的周转时间(标本送至检验科到结果回报临床的时间间隔)。

5 HB&L快速培养法 用一次性无菌注射器抽出1 mL脑脊液阳性培养液于无菌EP管中，吸取15 µL放入ALIFAX体液增菌瓶中继代培养。待仪器阳性报警后，将体液增菌瓶混匀，取1 ～ 2滴阳性增菌液涂片，革兰染色，若镜检为两种及两种以上菌形态，则将2 ～ 3滴阳性菌液接种于哥伦比亚血平板、麦康凯平板和不加万古霉素的巧克力平板，置于5% CO2、35℃培养箱中孵育18 ～ 24 h后常规进行鉴定和药敏试验；若镜检为一种菌形态，则各取1 mL于2管无菌EP管中，13 000 r/min离心5 min；弃上清，余下沉淀物中加300 µL注射用水洗涤，13 000 r/min离心5 min；弃上清，取1 µL沉淀均匀涂布于质谱仪靶板上，晾干；加1 µL 70%甲酸；晾干，加1 µL基质液；晾干，上机行菌种鉴定。上述沉淀物用VITEK-2 Compact仪器直接进行药敏试验，并记录鉴定和药敏的周转时间。

6 判读标准 1)菌种鉴定标准如下：＞2.0分，鉴定到种水平；1.700 ～ 1.999分，鉴定到属水平；＜1.7分，不可靠鉴定。2)药敏试验标准：药敏结果的符合率和错误率参照ISO20776-2标准，当比对结果完全满足表1要求时，则为可接受。

表1 药敏试验结果符合性判断标准Tab. 1 Criteria for judging the conformity of drug sensitivity test results

7 统计学分析 采用SPSS 26.0软件进行统计分析，GraphPad Prism 8软件作图，不符合正态分布的计量资料以Md(IQR)表示，组间比较采用非参数秩和检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 两种鉴定结果比较 37例脑脊液阳性标本中，革兰阳性菌16例，革兰阴性菌19例，真菌2例。以常规结果法为参照，HB&L快速培养法的鉴定正确率为100%。见表2。

表2 常规法与HB&L快速培养法鉴定结果比较Tab. 2 Comparison of identification results between conventional culture method and HB&L rapid culture method

2 两种培养法药敏试验结果比较 HB&L系统鉴定出19株革兰阴性菌，其中1株为嗜麦芽窄食单胞菌，选择左氧氟沙星、复方新诺明和米诺环素3种抗菌药敏纸片做药敏试验，结果符合率为100%。其余18株革兰阴性菌药敏试验中仅有替加环素、阿米卡星、米诺环素结果符合率为94.44%(17/18)，其他抗菌药物结果符合率均为100%。HB&L系统鉴定出13株革兰阳性球菌，药敏试验中红霉素结果符合率为92.31%(12/13)，其他抗菌药物结果符合率为100%。HB&L系统鉴定出2株酵母样真菌，用ATB FUNGUS 3试剂盒做药敏试验，两性霉素B、伊曲康唑、氟胞嘧啶、沃尔康唑、氟康唑5种抗菌药物结果符合率为100%。

3 HB&L法药敏结果标准率 本研究共获得365个药敏结果，以常规法为参照，HB&L快速培养法标准总符合率为98.90%(361/365)，极严重错误率为0.27%(1/365)，严重错误率为0(0/365)，一般错误率为0.82%(3/365)。见表3。

表3 HB&L快速培养法药敏结果符合率(n, %)Tab. 3 Coincidence rate of drug sensitivity results of HB&L rapid culture method (n, %)

4 两种鉴定和药敏试验周转时间比较 37例脑脊液阳性标本，常规法鉴定细菌的中位时间为48.42(45.71，50.47) h，HB&L快速培养法为26.32(23.34，32.58) h，常规法药敏试验的中位时间为71.55(69.70，88.64) h，HB&L快速培养法为46.78(40.32，56.57) h，HB&L快速培养法鉴定和药敏周转时间显著缩短(P＜0.001)。见图1。

图1 常规法与HB&L快速培养法鉴定和药敏周转时间比较Fig.1 Identification and comparison of drug sensitivity turnover time between culture method and HB&L rapid culture method

讨 论

随着脑部肿瘤、外伤等开颅手术介入治疗的增加，中枢神经系统感染率逐渐上升，不及时治疗，死亡率高达30.0%以上[13-15]。中枢神经系统感染诊断金标准是脑脊液培养阳性[16]。然而常规方法的鉴定和药敏试验需要3 ～ 5 d，特殊菌种时间更长，期间医生通常会经验性用药，从而导致抗菌药物滥用和耐药菌株产生，进一步影响临床治疗效果[17]。因此尽早提供鉴定和药敏结果，有助于医生快速合理选择用药。

HB&L系统是基于激光浊度法，从细菌接种到特定的肉汤培养，实时监测细菌的生长曲线和定量细菌计数(CFU/mL)。HB&L系统是快速、全自动的增菌仪器，操作简便、快捷、成本合适。目前，HB&L系统体液增菌瓶有脑脊液专用的DEB肉汤，它能保证流感嗜血杆菌、脑膜炎奈瑟菌等苛养菌生长。Altun等[18]研究表明，该仪器8 h出阴性结果，强阳性标本可在45 min报警。

本研究以传统方法鉴定结果为金标准，HB&L快速培养法鉴定结果正确率为100%，比Bishop等[19]将阳性标本离心，直接用MALDITOF MS鉴定正确率(81.00%)更高，进一步证实HB&L系统的优越性。单一菌株感染时，鉴定结果全部正确，本文中剔除2例混合感染的脑脊液样本，HB&L快速培养法鉴定结果仅为其中一种菌结果，可能原因是不同细菌生长特性不同，经过短期培养后，存在差异，弱势菌株生长量未达到质谱仪检测的最低检出限，故检测不出。因此，HB&L系统适用于单一菌种的快速培养，对于两种及两种以上菌的感染，需要与其他方法结合，使检测结果准确性更高。

从HB&L快速培养法药敏试验的符合率来看，革兰阴性菌、革兰阳性菌和真菌药敏试验结果分类符合率分别为99.17%、98.72%和100%。极严重错误和一般错误均在可接受范围内。与Pan等[20]的研究结果高度一致，进一步显示HB&L系统药敏试验具有较高的可信度和优越性。利用HB&L系统培养，可避免常规培养或药敏试验耗时长、报告慢、临床经验性用药等影响治疗疗效的问题。

从两种方法的周转时间来看，与常规方法比较，HB&L快速培养法获得鉴定和药敏结果的周转时间显著缩短。本研究中，HB&L快速培养法与常规法鉴定细菌的周转时间相差22.10 h，与药敏试验的周转时间相差24.77 h(P＜0.001)。HB&L快速培养法能提前1 d回报结果，有助于临床早期定向治疗，提高治愈率。

综上所述，经HB&L系统增菌后的菌液沉淀物，可直接用质谱仪鉴定，亦可直接用VITEK-2 Compact仪器做药敏试验，具有较高的鉴定准确率和药敏符合率，且显著缩短周转时间，是快速细菌鉴定及药敏试验的新方法，有助于临床更快速、准确地获得病原学证据，及时定向选择抗菌药物，提高治愈率。本研究不足之处在于仅收集到2株真菌，虽然HB&L快速培养法与常规法的鉴定与药敏结果一致，周转时间缩短24 h，但仍然需要增加株数。另外，本研究中脑脊液阳性标本偏少，后续将扩大标本量进一步分析。