microRNA与其在血管性痴呆中作用的研究进展

孙孟艳，秦合伟,2，牛雨晴，宋雪梅，郭 宁，王梦楠

1 河南中医药大学，河南郑州 450046；2 河南中医药大学第二附属医院，河南郑州 450002

血管性痴呆(vascular dementia，VD)是由缺血性脑卒中、出血性脑卒中等脑血管损伤性疾病引起的认知功能障碍综合征，其临床表现为记忆力下降、步态障碍、情绪失调和人格改变等。据世界卫生组织报道，VD作为仅次于阿尔茨海默病的第二大常见痴呆类型，预计2050年患病人数将增长至约8 200万[1]。由于病因尚未明确，目前VD治疗主要是支持措施和危险因素控制，迫切需要新的药物治疗靶点。越来越多的研究发现，非编码RNA，尤其是microRNA(miRNA)可通过诱导机体神经元自噬、氧化应激及血-脑脊液屏障受损等多种机制参与VD发生发展，是导致VD功能变化的重要生物学因素，外界药物可通过调控miRNA来缓解VD[2]。因此，本文通过总结miRNA干预VD的发病机制与治疗进展，重点关注miRNA在VD中的作用，为日后VD临床诊断与药物干预提供新的理论依据。

1 miRNA概述

miRNA是一类由17 ～ 25个核苷酸组成的小型非编码RNA，通过识别靶信使RNA(messenger RNA，mRNA)中的特定序列来介导基因沉默[3]。miRNA的种类自1993年在秀丽隐杆线虫中被首次发现后，便呈暴发式增长，迄今为止在人类机体内发现的miRNA组已超过2 500个[4]。当前研究证据证明，miRNA在正常生理或病理条件下以空间或时间受控的方式在中枢神经系统中高度表达，特定miRNA在突触可塑性、神经炎症、细胞凋亡与自噬中发挥着重要功能[5]。

1.1 miRNA与生物合成过程 miRNA基因位于基因间区域和非编码或编码转录本的内含子中，其生物发生始于细胞核，由多个步骤所介导：初级miRNA转录物的转录、Drosha的核加工、核质输出、Dicer的细胞质加工以及与AGO2蛋白形成RNA诱导的沉默复合物[4-8]。典型miRNA在RNA聚合酶Ⅱ/Ⅲ转录后形成具有帽子结构和含PolyA尾的pri-miRNA，pri-miRNA在细胞核中通过Drosha/DGCR8的微处理器复合物或由剪接机制组件以序列独立但结构依赖的方式切割，形成pre-miRNA[5,7]。pre-miRNA依赖Ran-GTP复合物通过exportin-5主动输入到细胞质中，细胞质内GTP向GDP的转变更有助于exportin-5释放premiRNA；细胞质中Dicer与TRBP结合并二次切割pre-miRNA，生成miRNA-3p/miRNA-5p，将其整合到含有AGO2家族蛋白为核心成分的RNA沉默复合体(RNA-induced silencing complex，RISC)中，以序列特异性方式与靶序列的3'-非翻译区(3'-untranslated region，3'-UTR)结合，诱导靶mRNA降解或翻译抑制来调节靶基因表达[6,8]。

1.2 miRNA与转录翻译、信号传递 一个miRNA可同时靶向位于同一细胞信号通路的多个基因，同时介导靶mRNA降解、调节靶基因转录翻译，影响机体诸多重要的生物学过程，如细胞周期、组织分化和细胞凋亡等[9-10]。在miRNA和靶mRNA互补情况下，含有miRNA引导链的RISC复合物通过其3'-UTR与靶mRNA结合发挥作用，随后mRNA去乙酰化、翻译抑制，最后完成降解[5,11]。此外，miRNA还可发挥细胞间信号转导作用[3]。研究表明，细胞外miRNA转运主要有两种机制，细胞外泌体主动转运或与AGO2、核磷蛋白1和高密度脂蛋白等蛋白质形成蛋白质-miRNA复合物转运，通过这两种途径介导机体不同组织之间的旁分泌与内分泌信号转导，调控基因表达和远端细胞功能[12]。因此，通过分离与检测不同细胞或组织中的miRNA基因表达状况，判断miRNA在细胞与组织间信息转导潜力，可作为诊断某种组织或细胞源性疾病的生物标志物。

2 miRNA与血管性痴呆的临床相关性

miRNA是内源性非编码RNA，可通过与一种或多种mRNA的3'-UTR结合，发挥负调控基因表达、翻译抑制多种调节信号通路中的数百种蛋白质的作用，其生理表达对于维持大脑健康发育与功能至关重要，因此脑细胞中miRNA水平的不平衡可能会增加VD以及其他神经系统性疾病的易感性[13]。越来越多的研究发现，miRNA通过调控细胞自噬与凋亡、加重炎症反应、影响突触功能等途径在VD动物模型的发病机制中起着关键作用。慢性脑灌注不足是导致血管性认知障碍与血管性痴呆的关键机制，Wei等[14]研究发现VD患者及双侧颈总动脉持久性结扎(two vessel occlusion，2VO)诱导的慢性脑灌注不足大鼠模型血清和脑脊液中miRNA-9-5p水平均显著升高，而给予miRNA-9-5p拮抗剂则可抑制血清与脑脊液中miRNA-9-5p表达，减轻学习记忆障碍及突触损伤，恢复胆碱能神经元功能并发挥神经保护作用，抑制氧化应激以及神经元损伤，这表明抑制miRNA-9-5p表达可能是治疗因慢性脑灌注不足导致的VD的潜在干预靶点。Prabhakar等[15]通过定量聚合酶链反应阵列对VD患者血清中miRNA分析研究发现，与认知正常的对照组相比，VD受试者血清中miRNA-409-3p水平显著下降，miRNA-502-3p、miRNA-486-5p和miRNA-451a水平呈现显著上调，即血清中不同miRNA具有作为识别VD生物标志物的潜力。因此，不同类型miRNA表达水平在VD中的作用具有双面性，某种特定类型miRNA可通过翻译后修饰作用于内外信号通路中的蛋白质，发挥调节机体认知功能的作用，但其具体机制还需进一步研究。

3 miRNA在血管性痴呆发生、发展中的作用

VD是一种由脑血管疾病引起的记忆力与其他认知功能进行性恶化的神经系统疾病，诱导其发生的机制是多方面的，如神经元自噬与凋亡、氧化应激、神经炎症反应和血-脑脊液屏障受损等[16]。miRNA通过抑制蛋白质翻译、与mRNA的3'-UTR结合降解mRNA或激活基因表达直接靶向启动子序列，特定miRNA的异常表达可能与多种中枢神经系统疾病有关，主要可能通过以下几个方面诱导VD发生发展[13]。

3.1 miRNA参与调节血-脑脊液屏障 血-脑脊液屏障(blood brain barrier，BBB)是由内皮细胞通过神经血管单元中的周细胞、星形胶质细胞、神经元和小胶质细胞相互作用所构成的动态代谢界面，可以双向调节中枢神经系统与循环系统之间的液体、溶质与细胞运输，能够有效阻止其他有害物质进入神经系统，起到保护神经系统功能的作用，保证其完整性的关键物质是脑内皮细胞之间的紧密连接，这些连接由一系列连接分子控制，包括紧密连接分子和黏附连接分子[17]。大量研究数据表明，miRNA可通过影响血-脑脊液屏障结构单个蛋白质的翻译功能直接损害连接分子生理功能，使血-脑脊液屏障功能受损，诱发机体神经炎症及免疫反应，直接或间接促进VD发生发展[18]。Ma等[19]研究发现，VD患者机体中miRNA-21表达水平升高，连接蛋白occludin、β-catenin是其对应的靶基因，过表达的miRNA-210可通过下调连接蛋白occludin和β-catenin表达，诱导破坏紧密连接蛋白导致病理条件下血-脑脊液屏障通透性增加。Ma等[20]研究证实，miRNA-15a/16-1簇可通过下调claudin-5的表达，介导血-脑脊液屏障分解，敲除内皮细胞miRNA-15a/16-1基因簇则可以减轻血-脑脊液屏障渗漏，减少外周巨噬细胞和中性粒细胞浸润，缓解VD相关症状。此外，Zhang等[21]发现miRNA-182过表达可通过直接调控下游靶向因子FoxO1，促使claudin-5表达下降，损害血-脑脊液屏障连接分子生理构成，即miRNA-182可通过激活mTOR/FoxO1通路促使内皮细胞凋亡，抑制连接分子claudin-5表达，使血-脑脊液屏障受损、通透性增加，miRNA-182基因敲除则可通过mTOR/FoxO1通路减少内皮细胞凋亡来保护BBB完整性。ZO-1是血-脑脊液屏障高表达的紧密连接分子，可作为miRNA-501-3p下游靶基因调控血-脑脊液屏障生理完整性。Toyama等[22]在对VD小鼠模型的研究中发现，miRNA-501-3p的表达与其靶标ZO-1呈负相关，即miRNA-501-3p可通过直接靶向ZO-1表达下降调控炎症反应并诱导血-脑脊液屏障分解，使用特异性抑制剂抑制miRNA-501-3p则可使ZO-1基因表达上调，恢复白质内血-脑脊液屏障的完整性并改善工作记忆障碍。p53是miRNA-143的靶向基因，其表达水平降低可促进细胞凋亡。Bai等[23]发现，miRNA-143在VD患者表达水平升高，其通过负向调控p53表达水平发挥促VD作用；当沉默miRNA-143基因表达时，通过靶基因p53上调细胞凋亡调节剂PUMA来保护血-脑脊液屏障的完整性，因此miRNA-143可通过调节miRNA-143/p53轴来干预血-脑脊液屏障功能状态。

3.2 miRNA干预突触可塑性 以往研究证实，机体长期记忆与认知的形成取决于新蛋白质的表达合成，神经元突触中的局部蛋白质对于神经元活动诱导的突触变化至关重要，即机体无论处于何种状态下，突触中蛋白质表达合成水平对认知功能及突触可塑性起着关键作用[24]。miRNA可通过调控突触中相关蛋白质转录与翻译干预突触可塑性，诱导VD发生发展。钙离子/钙调素依赖性蛋白激酶Ⅱ(calcium/calmodulin-dependent protein kinase-Ⅱ，CAMKⅡ)是一种常见的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，可通过突触的长时程增强(long-term potentiation，LTP)参与学习记忆功能的形成[5]。研究发现，miRNA生物合成蛋白AGO2与CAMKⅡ表达合成水平呈负相关，当AGO2敲除时，CAMKⅡ局部表达水平增加，表明miRNA可通过调节CAMKⅡ的表达来调节突触可塑性，间接影响机体认知功能[25]。此外，Yan等[26]研究发现，miRNA-153在慢性脑灌注不足大鼠模型组织中的表达显著上升，表达水平与突触功能呈负相关，当敲除miRNA-153后2VO大鼠海马前囊泡释放增加，即慢性脑灌注不足大鼠模型可能通过miRNA-153介导的多种突触小泡相关蛋白的下调阻碍突触前小泡与突触前膜融合，从而损害神经突触功能。作为转录因子，Foxp2调节数百个下游靶基因的表达，其中许多基因以不同方式参与调节神经发育和功能，在突触可塑性中发挥重要作用，包括轴突生长、轴突引导与神经传递。Liu等[27]模拟VD早期病理试验，发现miRNA-134-5p表达水平在VD大鼠皮质区明显升高，并通过激活下游潜在靶标Foxp2的mRNA来调节突触蛋白的丢失，诱导机体认知障碍。因此，miRNA-134-5p/Foxp2/Syn1通路可能代表早期VD患者突触损伤和临床分子治疗策略的新靶点。Lu等[28]研究发现，miRNA-218可通过靶向调节AMPAR亚基GluA2表达水平调节突触可塑性，当海马神经元中miRNA-218缺乏会缩短树突轴，增加微型兴奋性突触后电流的频率和幅度，导致突触可塑性受损，这可能是miRNA-218参与诱导认知功能障碍的主要机制。这些结果均表明miRNA可通过调节靶向蛋白的合成与分解来影响突触可塑性的正常生理功能，这也可能会成为VD潜在的药物干预或治疗靶点。

3.3 miRNA诱发神经炎症反应 生理情况下，神经系统可通过产生促炎因子，如IL-1β、IL-6和TNF-α，保护调节大脑免受微生物侵害、促进组织修复和清除神经系统碎片；但在病理情况下，不受控制的神经炎症会导致组织损伤，成为诸多神经退行性病变的关键致病因素。目前研究表明，神经炎症与VD的病理生理学密切相关，与炎症相关的小胶质细胞可通过激活晚期糖化终产物受体RAGE引起认知障碍。RAGE受体大量存在于海马、颞叶内侧以及大脑额叶和边缘区域的小胶质细胞与神经元上，可通过激活NF-κB与Toll样受体(toll-like receptors，TLR)表达，诱发机体炎症与免疫反应，导致血管屏障受损以及神经元变性，促进VD发生[16]。众多证据证明，miRNA作为一种关键的免疫调节剂，可参与调节中枢神经系统炎症信号转导，在调节神经炎症和先天免疫反应中发挥着重要作用。Mao等[29]在一项动物实验中发现，miRNA-195通过调节CX3CL1/CX3CR1信号转导，诱导海马小胶质细胞/巨噬细胞向M1表型的极化，参与机体神经免疫反应与炎症反应，这表明了通过调节miRNA-195所介导的CX3CL1-CX3CR1信号通路可能是减轻VD神经炎症的潜在机制。Li等[30]研究发现，SIRT1是miRNA-210的下游靶向蛋白，在缺血缺氧性脑损伤大鼠模型中miRNA-210表达水平上调，诱导SIRT1基因使小胶质细胞M1活化并触发炎症级联反应；当在脑室内给予miRNA-210阻滞剂干预后可有效抑制小胶质细胞介导的炎症反应，从而减少脑损伤，证实了miRNA-210通过靶向调节SIRT1基因水平，减少NF-κB亚基p65的去乙酰化并增加NF-κB信号转导活性，诱发神经炎症反应。SOCS3是miRNA-3473b的靶基因，可调节胶质细胞中炎症因子的表达。Wang等[31]通过体内外试验研究发现，短暂大脑中动脉闭塞后小鼠皮质和纹状体中miRNA-3473b表达上调，通过靶向调节下游因子SOCS3使小胶质细胞与炎症因子活化增强，诱导神经炎症反应；当脑室给予miRNA-3473b阻滞剂干预后显著减弱缺血诱导的miRNA-3473b和促炎因子的表达。miRNA-155被认为是神经系统的促炎介质，主要通过在小胶质细胞和巨噬细胞中诱导NF-κB通路活化发挥促炎作用[32]。如Liu等[33]研究中发现，miRNA-155在VD小鼠模型中呈高表达，miRNA-155可诱导海马中IL-1β、IL-6和TNF-α表达增加传递炎症信号；沉默miRNA-155表达则可减少这些因子的上调并减弱Caspase-3的增加，从而恢复小鼠认知功能。

3.4 miRNA干预神经元自噬与凋亡 自噬和凋亡是两种类型的程序性细胞死亡，自噬由受损的细胞内细胞器、长效蛋白和部分细胞质被双层膜结构包裹形成自噬体，通过各种酶的消化降解，达到细胞自身代谢与某些细胞器的更新，对维持神经系统内环境具有重要作用[1]。当外部缺血缺氧压力下，神经元自噬通过PI3K/Akt/mTOR、Beclin-1/LC3A/B-Ⅱ/Atg5和AMPK/mTOR/ULK1信号通路被进一步激活，自噬的过度激活将致使自噬相关蛋白积累诱导细胞凋亡，加重机体学习记忆以及认知功能障碍[4]。越来越多的研究发现，miRNA在自噬与凋亡调节中发挥着重要作用。自噬的诱导取决于Atg蛋白表达，主要通过Atg8(LC3)-PE、Atg12-Atg5-Atg16L两种途径参与自噬体的形成。Zhang等[34]在一项动物实验中发现，脑内注射miRNA-299-5p可通过下调自噬基因Atg5水平，抑制VD小鼠海马区神经元自噬与细胞凋亡，改善小鼠认知能力，这表明miRNA-299-5p可作为VD潜在的神经保护因子，通过调节自噬调控神经元存活程序。Zhang等[35]研究显示，miRNA-103a-3p直接靶向Atg5调节自噬和细胞凋亡，当抑制miRNA-103a-3p后Atg5表达上调，并促使细胞自噬与凋亡。mTOR是调节细胞代谢的关键蛋白激酶，可诱导神经元生长和突触的长时程增强，此外mTOR作为自噬的抑制因子，其表达水平下调是自噬启动所必需条件[36]。Liu等[37]研究显示，miRNA-96水平在2VO大鼠中显著升高，并通过调节mTOR表达减少自噬；当干预Antagomir-96使miRNA-96表达抑制，mTOR蛋白质水平上调，使自噬失活从而改善小鼠认知功能。Zheng等[38]研究发现，TSPAN5是miRNA-322-5p的下游靶向因子，过表达miRNA-322-5p通过靶向调控TSPAN5水平减轻大鼠认知功能障碍与细胞损伤，而敲除miRNA-322-5p会诱发炎症反应和细胞凋亡，证实了miRNA-322-5p可作为临床干预VD的潜在靶点。

4 miRNA可作为血管性痴呆潜在的生物标志物

基于高通量测序技术与神经影像学技术的发展，当前已有临床试验与动物实验开始研究miRNA及其所调控蛋白质表达变化，以此为VD临床诊断与药物干预的潜在生物标志物提供理论依据。Prabhakar等[15]通过对204例VD患者与200例健康者的对照试验发现，在44种差异表达的miRNA中血浆miRNA-409-3p、miRNA-502-3p、miRNA-486-5p和miRNA-451a表达水平相对于健康对照组明显增加，可用于区分小血管VD患者与健康对照组并有望成为识别VD的潜在临床标志物。Wu等[39]在对71例参与者miRNA进行采集分析后发现，两个循环脑富集的miRNA，即miRNA-146b-5p和miRNA-15b-5p在VD组与对照组比较，差异有统计学意义，具有较高的敏感度和特异性，说明突触miRNA-146b-5p和miRNA-15b-5p可以成为诊断与干预神经退行性变的有效生物标志物。miRNA-222为抗血管生成的miRNA，其水平上调会导致血管壁内膜病变，Marchegiani等[40]在研究中发现，与健康对照和痴呆患者相比，VD患者miRNA-222水平显著增加，表明miRNA-222在VD诊断中可作为一种新型且有希望的生物标志物。检测miRNA不仅可以对相关疾病临床诊断做出判断，还有望通过检测miRNA类型追溯其临床病因，从源头解决VD来源问题。

5 结语与展望

VD是与脑血管损伤相关的进行性痴呆疾病，其临床预后较差，目前针对VD的治疗主要是支持措施和危险因素控制，因此寻找新的临床诊断与药物干预靶点成为该领域研究热点[1]。VD发病机制较为复杂，随着生物学信息与高通量测序技术的不断深入与发展，miRNA对VD干预机制受到关注，越来越多的研究证明细胞中miRNA表达水平的不平衡通过调控血-脑脊液屏障完整性、突触功能、神经炎症反应以及细胞自噬与凋亡等机制增加VD与其他神经系统疾病的发生率，证实miRNA可作为VD的临床潜在生物标志物，通过药物干预或定向敲除过表达miRNA最终达到治疗目的。当前已有学者开展药物研究调控miRNA减轻VD症状，如Wang等[41]通过针灸抑制miRNA-93介导的TLR4/MyD88/NF-κB信号通路减轻VD大鼠小胶质细胞的炎症反应，但总体来说基于miRNA治疗VD的临床应用还具有一定挑战，中西医干预VD尚缺乏系统性、多样性研究，临床试验数据偏少，转化为药物应用于临床患者还有很长的路要走，后续可以重点关注研究构建miRNA调控VD机制网络，这将有助于为miRNA在VD早期临床诊断干预中提供新的方向以及理论依据，为药物研究干预提供新的靶点。