不同碳源与氮源对枣树炭疽病菌的影响

张 苗，曹俊宇

（1.山西农业大学植物保护学院，山西太原 030001；2.吕梁学院，山西吕梁 033000）

枣树是一种适应能力非常强的植物[1]，能够适应旱涝和酸碱等较为极端的环境，在我国南北方均可种植。枣树结实周期短，开花量大，且果实营养丰富，能够作为良好的结实植物、蜜源植物[2]。吕梁枣产业利用沿黄各县红枣种植的优势，大力发展红枣种植加工，全区红枣基地面积达到11.13 万hm2，加工转化达4 000 kg。形成了以“山西天渊、山西天骄”为龙头的一大批红枣加工企业，产品远销日本、韩国、欧美等国家和地区[3-4]。

枣树炭疽病是由胶孢炭疽菌感染引起的且常见于枣树的一种病害[5-6]。病菌一般侵染枣树的果实、叶片和枣股等，被炭疽菌侵染后，叶片发黄、早落，产生黑褐色焦枯状斑点[7]；枣果表面产生黑褐色、圆形并向下凹陷的斑块，果肉也变成褐色的丝绵状，味苦，无法食用[8]；枣股中的病原菌如不进行清理和杀灭，会与病果中的菌丝一同成为次年的侵染源[9]。在炭疽病流行的年份，产量损失可高达80%[10]。

碳、氮是微生物生长必须的重要元素和生命代谢的基础物质，能提供生物体生长、发育和繁殖所需要的能量[11-12]，且不同的碳源和氮源对病原菌生长的影响不同[13-14]。枣炭疽病是枣生产中常见的病害之一，在我国各大枣种植产区均有发生。枣一旦染上炭疽病，对其产量及品质会造成较大影响，甚至会造成枣树的死亡。因此，本文研究碳源和氮源营养对枣树炭疽病菌菌丝生长、孢子萌发以及菌丝干质量三方面的影响，全面明确枣树炭疽病菌最适的营养条件，为今后研究枣树炭疽病菌的生物学特性、致病机制提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

枣树炭疽病菌菌株采自河南清丰，经北纳创联生物科技有限公司鉴定为胶孢炭疽病菌Glomerella cingulata（Stoneman）。不同碳源为葡萄糖、果糖、麦芽糖、蔗糖、可溶性淀粉，不同氮源为硝酸钠、硝酸钾、谷氨酸、尿素、硫酸铵，均为分析纯，天津市科密欧化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

振荡培养箱，ZHP100M 型，扬州三发科学仪器有限公司；干燥箱，DHG 型，上海善志仪器设备有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 碳源对枣树炭疽病菌菌丝生长的影响

参照张宝清等[15]的方法，略有改动。以察氏培养基为基础，替换其中的蔗糖，配制不同碳源（葡萄糖、果糖、麦芽糖、蔗糖、可溶性淀粉）的固态察氏培养基，并设无碳培养基作为空白对照。从培养7 d 的供试菌落边缘，打取长势相似的菌碟（直径6 mm），分别接入不同碳源的固体培养基中央，于25 ℃黑暗条件下倒置培养，7 d 后采用十字交叉法测量菌落直径，同时记录病菌长势特征（菌丝密度、边缘整齐度），每组处理进行3 次重复。

1.3.2 碳源对枣树炭疽病菌产孢量的影响

1.3.1中不同碳源培养基对菌丝生长的影响记录完毕后，在固体培养基上滴加蒸馏水，刮取菌丝并用双层纱布过滤，取滤液1 mL 定容至5 mL，制成孢子悬液。取洁净的血细胞计数板一块，将盖玻片盖在计数区。使用振荡培养箱将菌悬液充分摇匀，用滴管吸取少许，滴加于盖玻片下边缘。静置片刻，使细胞沉降到计数板上，不再随液体流动。将血球计数板置于显微镜的载物台上，先在10×10 倍镜下找到计数区后，再转换至10×40 倍镜下观察并计数，计算孢子数[12]。计算公式见式（1）。

式中，X为稀释倍数。

1.3.3 碳源对枣树炭疽病菌菌丝干质量的影响

以液态察氏培养基为基础，制备不同碳源（葡萄糖、果糖、麦芽糖、蔗糖、可溶性淀粉）的液体培养基，并设无碳培养基作为空白对照。灭菌后分装于250 mL 锥形瓶中，每瓶装入100 mL。从培养7 d 的供试菌落边缘，打取长势相似的菌碟（直径6 mm），分别接入液体培养基中，每个锥形瓶接菌碟两块，置于振荡培养箱中以120 r/min转速连续震荡培养。在培养7 d 后，用已烘干且称量质量的滤纸过滤，将菌丝连同滤纸一起放入干燥箱内，90 ℃烘干处理2 h，随后称量菌丝的干质量，每组处理进行3次重复。

1.3.4 氮源对枣树炭疽病菌菌丝生长的影响

参照李青等[16]的方法，略有改动。以察氏培养基为基础，替换其中的硝酸钠，配制不同氮源（硝酸钠、硝酸钾、谷氨酸、尿素、硫酸铵）的固态察氏培养基，并设无氮培养基作为空白对照。其余同1.3.1。

1.3.5 氮源对枣树炭疽病菌产孢量的影响

1.3.4中不同氮源培养基对菌丝生长的影响记录完毕后，按照1.3.2 的方法制备好孢子悬浮液并计数。

1.3.6 氮源对枣树炭疽病菌菌丝干质量的影响

处理设置同1.3.4，基础培养基不加琼脂，制备成不同氮源（硝酸钠、硝酸钾、谷氨酸、尿素、硫酸铵）的液体察氏培养基，并设无氮培养基作为空白对照，按照1.3.3 的方法称量菌丝干质量。

1.4 数据分析

本实验所收集数据均使用SPSS 26.0 软件进行处理及分析。所测指标使用Shapiro-Wilks 进行正态分布检测，发现均基本符合正态分布，因此采用一般线性模型（GLM）进行单变量方差分析，利用Duncan 法进行不同处理组间的多重比较。文中图片均在Excel 2010 中绘制。

2 结果与分析

2.1 碳源对枣树炭疽病菌的影响

2.1.1 不同碳源对病菌菌丝生长的影响

由表1 可知，不同碳源对枣树炭疽病菌菌落长势影响各不相同。菌丝密度由大到小的处理依次为葡萄糖（最浓密）、可溶性淀粉（浓密）、麦芽糖（浓密）、果糖（浓疏）、无碳源（较稀疏）、蔗糖（稀疏）。对于色泽，菌落在不同碳源的培养基上均呈同心轮纹状，从中央到边缘颜色由深变浅。对于菌落整齐度，除蔗糖和CK 处理边缘不规则外，其他处理菌落均生长整齐。对于菌丝生长速率而言，碳源对其的影响是显著的（F5,12=36.86，P＜0.001）。除蔗糖外，与CK 组生长速率（8.14±0.14）mm/d 相比，其余碳源的加入均有利于枣树炭疽病菌的生长，但是利用程度也存在差异。其中葡萄糖为碳源时，利用率最高，菌丝生长速率可达（10.04±0.10）mm/d；可溶性淀粉、麦芽糖次之，菌丝生长速率分别为（9.39±0.30）、（9.27±0.18）mm/d；果糖为碳源时，病菌利用率较差，菌丝生长速率为（8.51±0.11）mm/d。

表1 不同碳源对枣树炭疽病菌菌丝生长状况的影响Table 1 Effects of different carbon sources on the mycelium growth of G. cingulata

2.1.2 不同碳源对病菌产孢量的影响

由图1 可知，不同碳源对枣树炭疽病菌产孢量有极显著的影响（F5,12=9.494，P=0.001），且与CK 组产孢量0.58×106个相比，其余碳源的加入均有利于枣树炭疽病菌孢子的产生，但是产孢量也存在差异。其中，当可溶性淀粉为碳源时，产孢量最多，达5.33×106个；当葡萄糖、果糖、麦芽糖次之，产孢量相当，分别为4.04×106、4.08×106和4.08×106个；蔗糖为碳源时，产孢量最少，仅为3.29×106个。

图1 不同碳源对枣树炭疽病菌产孢量的影响Fig.1 Effect of different carbon sources on the spore yields of G. cingulata

2.1.3 不同碳源对病菌菌丝干质量的影响

由图2 可知，不同碳源液体培养基对枣树炭疽病菌菌丝干质量均产生了显著的影响（F5，2=5.106，P=0.010）。与CK 组菌丝平均干质量（0.02 g）相比，其余碳源的加入均有利于枣树炭疽病菌菌丝的生长。其中，病菌在以可溶性淀粉为碳源的液体培养基中，菌丝生长量最大，干质量达到了0.41 g；在以蔗糖、葡萄糖、麦芽糖为碳源时，菌丝生长量次之（三者之间无显著差异），干质量分别为0.37、0.23、0.22 g；在以果糖为碳源的液体培养基中菌丝生长量最小，干质量为0.19 g。

图2 不同碳源对枣树炭疽病菌菌丝干质量的影响Fig.2 Effect of different carbon sources on the mycelial dry weight of G. cingulata

2.2 氮源对枣树炭疽病菌的影响

2.2.1 不同氮源对病菌菌丝生长的影响

由表2 可知，不同氮源对枣树炭疽病菌菌丝生长速率的影响非常显著（F5,12=75.673，P＜0.001）。以硝酸钠、谷氨酸为氮源时，病菌菌丝生长良好，生长速率快，分别为（9.29±0.22）mm/d、（9.21±0.10）mm/d；以尿素、硫酸铵为氮源时，生长速率较慢，分别为（6.45±0.05）mm/d 和（6.75±0.02）mm/d，且病菌菌丝较稀疏，菌落边缘不整齐，整体长势较差；对于无氮源处理组而言，病菌菌丝生长速率较快，为（9.11±0.06）mm/d，但菌丝稀疏，边缘不整齐，整体长势最差。

表2 不同氮源对枣树炭疽病菌菌丝生长状况的影响Table 2 Effects of different nitrogen sourceson the mycelium growth of G. cingulata

2.2.2 不同氮源对病菌产孢量的影响

由图3 可知，不同氮源处理对枣树炭疽病菌产孢量有极显著的影响（F512=27.349，P＜0.001），且与CK 组产孢量（0.83×106）个相比，其余氮源的加入均有利于枣树炭疽病菌孢子的产生，但是产孢量也存在差异。其中，硝酸钾、硝酸钠、谷氨酸为碳源时，产孢量较多，分别是8.50×106、8.33×106、7.25×106个；尿素、硫酸铵次之，分别为4.42×106、3.83×106个。

图3 不同氮源对枣树炭疽病菌产孢量的影响Fig.3 Effect of different nitrogen sources on the spore yields of G. cingulata

2.2.3 不同氮源对病菌菌丝干质量的影响

由图4 可知，不同氮源液体培养基对枣树炭疽病菌菌丝干质量均产生了显著的影响（F5,12=26.652，P＜0.001）。与CK 组菌丝平均干质量（0.003 g）相比，其余氮源的加入均有利于枣树炭疽病菌菌丝的生长。其中，病菌在以谷氨酸、尿素为碳源的液体培养基中，菌丝生长量最大，干质量分别达到了0.49、0.46 g；在以硝酸钾、硫酸铵和硝酸钠为碳源时，菌丝生长量次之（三者之间无显著差异），干质量分别为0.28、0.28、0.24 g。

图4 不同氮源对枣树炭疽病菌菌丝干质量的影响Fig.4 Effect of different nitrogen sources on the mycelial dry weight of G. cingulata

3 总结

营养元素是病原菌生长不可缺少的条件，碳源和氮源是病菌生长中最基本、最重要的两大要素[15]，结果表明，枣树炭疽病菌能利用葡萄糖、果糖、麦芽糖、蔗糖、可溶性淀粉5 种供试碳源，但对不同碳源之间的利用程度有差异。从平板菌丝的整体生长状况而言，最佳碳源是葡萄糖，而蔗糖作为碳源时不利于平板病菌的生长，这与王艳等[17]关于铁皮石斛炭疽病菌（G.cingulata）和邓先琼等[18]关于布朗李炭疽病菌（G.cingulata）研究结果有所不同。这可能与寄主的变化有关。对于病菌产孢量与菌丝干质量而言，相较于无碳源环境，碳源的存在更适合病菌的生长，当碳源是可溶性淀粉时，产孢量最多，菌丝干质量也最大，说明这种碳源既适合液体菌丝生长，也适合产孢；当碳源是葡萄糖、果糖、麦芽糖时，产孢量较高，干质量较低，说明这三种碳源更适宜病菌孢子的生长；当碳源是蔗糖时，产孢量最少，但干质量较高，说明此碳源更适宜液体菌丝的生长。这与陈国平等[19]对梨炭疽病菌（G.gloeosporioides）和唐爽爽等[20]对西瓜炭疽病菌（G.orbiculare）所报道的蔗糖最适宜产孢的结果不同，这可能与种间差异或者寄主植物不同有关。

枣树炭疽病可利用有机氮、铵态氮、硝态氮等多种氮源，但是利用程度同样存在差异，结果显示，从平板菌丝的整体生长以及产孢量来看，本试验中供试的5 种氮源（硝酸钠、尿素、硝酸钾、硫酸铵、谷氨酸），整体来看，硝酸钠最适宜作为氮源，硫酸铵作为氮源时利用率最差，尿素次之，该病菌对氮源硝酸钠的高效利用与张宝清等[15]对海棠炭疽病菌（G.truncatum）和汤吉[21]对棉花炭疽病菌（Colletotrichumsp.）的研究结果相吻合。硫酸铵作为氮源对枣树炭疽病菌生长的抑制作用，与范昆等[22]对无花果炭疽病菌（G.gloeosporioides）和钟荣顺等[13]对大豆炭疽病菌（G.truncatum）的研究结果相类似。对于菌丝干质量而言，尿素作为氮源时液体菌丝生长量较好，硝酸钠最差。

总之，虽然枣树炭疽病菌在不同碳氮源培养基中均能生长，但对菌丝生长状况、产孢量以及菌丝干质量的影响有较大差异。因此，仅通过单一指标的比较，不能客观地反映病菌的生长状况。本试验将固体培养基上菌丝生长速率、产孢量与液体培养基菌丝干质量等指标综合考察，有利于真实地反映炭疽菌病菌生长与营养之间的关系，为进一步完善枣树炭疽病菌的营养生理、生物学特性提供一定的参考。