玉米大斑病菌高效原生质体的制备方法研究

陈绪遥

（重庆市渝中区绿化维护管理处，重庆 400010）

玉米是重要的粮食作物和重要的饲料来源，也是全世界总产量最高的粮食作物，可用作饲料、食物和工业原料。玉米籽粒可以加工为酒精，玉米秆可用于造纸和制墙板，苞叶可作填充材料和草艺编织，玉米穗轴可作燃料，也用来制作工业溶剂，茎叶除用作牲畜饲料外，还是沼气池的原料。

我国自16 世纪初引入玉米以来，已有近500 年的种植历史，目前全国各地都有种植。在我国，玉米已不再是主要的口粮作物，更重要的是作为发展畜牧业的优良饲料，也是轻工业和医药工业的重要原料，近年来又成为生物质能源的重要原料。因此，玉米生产不仅影响到农业，而且影响到社会经济发展的许多方面。

1 玉米大斑病简介

玉米大斑病是世界玉米生产中发生普遍和严重的一种叶枯性病害，主要分布于较冷凉的玉米种植区，多雨和多露年份常引起病害流行，造成严重减产[1]。玉米大斑病菌属半知菌亚门真菌。大斑病菌分两种专化型，一种是对玉米有专化致病性的玉米专化型，一种是对高粱有专化致病性的高粱专化型[2]。温度20～25 ℃、相对湿度90%以上利于病害发展。气温高于25 ℃或低于15 ℃、相对湿度小于60%，持续几天则病害的发展会受到抑制。

玉米大斑病菌称大斑凸脐蠕孢，属半知菌亚门真菌。玉米大斑病菌的分生孢子梗自气孔伸出，单生或2～3 根束生，褐色不分枝，正直或膝曲，基细胞较大，顶端色淡，有2～8 个隔膜。分生孢子呈梭形或长梭形，榄褐色，顶细胞钝圆或长椭圆形，基细胞尖锥形，有2～7 个隔膜，脐点明显，突出于基细胞外部。有性态称为玉米毛球腔菌。自然条件下一般不产生有性世代。成熟的子囊果黑色，椭圆形至球形，外层由黑褐色拟薄壁组织组成。子囊果壳口表皮细胞产生较多短而刚直、褐色的毛状物。内层膜由较小透明细胞组成。子囊从子囊腔基部长出，夹在拟侧丝中间，圆柱形或棍棒形，具短柄。子囊孢子无色透明，老熟呈褐色，纺缍形，多为3 个隔膜，隔膜处缢缩[3]。

玉米大斑病又称条斑病、煤纹病、枯叶病、叶斑病等[4]，主要为害玉米的叶片、叶鞘和苞叶。叶片染病先出现水渍状青灰色斑点，然后沿叶脉向两端扩展，形成边缘暗褐色、中央淡褐色或青灰色的大斑。后期病斑常纵裂。严重时病斑融合，叶片变黄枯死。潮湿时病斑上有大量灰黑色霉层。下部叶片先发病。在单基因的抗病品种上表现为褪绿病斑，病斑较小，与叶脉平行，色泽黄绿或淡褐色，周围暗褐色，有些表现为坏死斑。

玉米大斑病的防治应以种植抗病品种为主，加强农业防治，辅以必要的药剂防治[5]。要选择抗病品种，适期早播，避开病害发生高峰。施足基肥，增施磷钾肥。对于价值较高的育种材料及丰产田玉米，可在心叶末期到抽雄期或发病初期喷洒50%多菌灵可湿性粉剂500 倍液或50%甲基硫菌灵可湿性粉剂600 倍液、75%百菌清可湿性粉剂800 倍液、25%苯菌灵乳油800 倍液、40%克瘟散乳油800～1 000 倍液、农抗120 水剂200 倍液，隔10 d 喷施1 次，连续防治2～3 次[6]。

2 材料和方法

2.1 试验材料

供试菌株、质粒与培养基分别为玉米大斑病菌、PDA 固体培养基土豆20%（w/v）、葡萄糖1.8%（w/v）、琼脂1.8%（w/v）。

试剂为纤维素酶、蜗牛酶。

试验仪器为超净工作台、超纯水器（MillIPORE，美国）、立式高速离心机（Himac CR22F，日本）、低温台式离心机（SoRVall fresco，德国）、摇床、恒温培养箱、移液枪、电子天平、破碎仪、电击仪等。

2.2 试验方法

2.2.1 试验菌株单孢菌落的获取

采用平板培养玉米大斑病菌或者单孢分离方法获取菌株单孢菌落。常用的单孢分离方法主要有平板稀释法、眉毛针挑取法、微块注射法、直接挑取法。

本试验利用玉米大斑病菌试验株的玉米大斑病叶，将病叶上的病斑剪下，再剪成边长为1 cm 的正方形，以便培养。

将剪成的正方形病斑叶片放入盛有75%酒精的烧杯中消毒，重复3 次，最后用无菌水冲洗1 次，将洗好的病叶放入干净培养皿中备用。

配制PDA 培养基，称取200 g 去皮洗净的土豆，切成正方体小块，取600 mL 蒸馏水倒入锅中，将切好的土豆放入锅中，将土豆块煮到熟而不烂的程度，注意在此过程中一定要小心，不要黏锅，随时用玻璃棒搅拌，必要时候加入少许蒸馏水以防黏锅。煮好后过滤，将土豆滤除，加入10 g 葡萄糖，定容至1 000 mL，分装至4 个锥形瓶中，封口，灭菌备用。将玉米大斑病菌放入PDA培养基中逐步分离纯化，即得到玉米大斑病菌的单孢子，储存备用。

2.2.2 载体制备

单孢分离之前，制作孢子载体用于试验。操作方法：将水琼脂培养基倒入直径为65 mm 的干净灭菌培养皿内，控制培养基厚度在1～2 mm 为最佳；待培养基凝固后，用已消毒的洁净小手术刀将已经倒入培养皿中的培养基划分成宽度相等的3 条带，挑出一条置于载玻片上备用。

2.2.3 孢子选取

如果病叶上的孢子较多，可直接将病叶在距离孢子载体上方大约10 cm 的高度轻轻用手敲打叶片，使病叶上的玉米大斑病菌孢散落在孢子载体上。

如果叶片上的孢子不是很多，用病叶轻轻地在孢子载体上擦拭，然后将载体转移到4 倍显微镜观察是否为单孢子，如不是，用已灭菌的干净涂布器蘸取少许无菌水从孢子载体的一端向另一端轻轻涂布，直到在4 倍显微镜下观察到一个个单孢子为止。

2.2.4 蘸取单孢

将挑孢针烧红，待针头超微冷却下来，右手拿挑孢针在显微镜头下轻轻用针头接近孢子载体，慢慢移动，直到在镜头下看不到单孢子的存在，便成功地挑取了单孢子。

2.2.5 转移单孢

提前在直径为90 mm 的PDA 培养皿（加入适量硫酸链霉素）上用黑色记号笔做出4 个标记，将实验室自制的挑孢针针尖在一个标记处轻轻划动4～5 次，将孢子转移出来。用相同的方法在另外3 个培养皿的标记处接种，然后用封口膜将培养皿封存保护好，置于培养箱中培养，培养温度为26 ℃。

2.2.6 转移大斑病菌菌落

在培养箱中培养了4 d 之后，得到玉米大斑病菌的单株菌落。在1～4 个培养基中，2 号菌株长势最好，故选择2 号培养基中的菌株，将其转移到斜面培养基中，保存备用。

2.2.7 配制渗透压稳定剂

STC 溶液：含有1.2 mol/L 山梨醇、0.01 mol/L Tris、0.05 mol/L CaCl2，调整pH 值为7.5。

NaCl 溶液：0.3 mol/L、0.5 mol/L、0.7 mol/L、1.0 mol/L、1.2 mol/L。

甘露醇溶液浓度：0.3 mol/L、0.4 mol/L、0.5 mol/L、0.6 mol/L、0.8 mol/L、1.0 mol/L。

MgSO4溶液浓度：0.3 mol/L、0.5 mol/L、0.7 mol/L、0.9 mol/L，用0.02 mol/L 磷酸缓冲液配制而成。

山梨醇溶液浓度：0.6 mol/L、0.8 mol/L、1.0 mol/L、1.2 mol/L、1.4 mol/L。

以上溶液均用去离子水配制。

2.2.8 单孢子菌株的获得

玉米大斑病菌在25 ℃下活化3 d，用调针挑取长势较好的一部分菌体接入至150 mL PD 液体培养基中，放入25 ℃的真菌专用摇床中，将摇床的速度设定为150 r/min，培养6 d 之后取出。经历5 次重复后，得到性状稳定的单孢子菌株。

2.2.9 裂解玉米大斑病菌的细胞壁

裂解酶为纤维素酶、蜗牛酶。

将实验室制备好的供试玉米大斑病菌的供试菌株接种于5 mL 的PD 液体培养基中，在25 ℃温度下放入摇床（200 r/min）中振荡培养24 h。取出菌体切断菌体并将其转接于50 mL 液体培养基中继续在摇床中再次振荡培养24 h，离心收集菌体。加入灭菌的渗透压稳定剂，再用无菌水冲洗两次。在离心之前，本试验用50 目尼龙筛过滤后收集菌体。无菌水洗涤2～3 次，试验采用的是离心洗涤，将速度和时间分别设定为8 000 r/min、10 min。称取已经制备好的纯化1 g 玉米大斑病菌菌体，轻轻移入无菌试管离心管组织匀浆器中缓慢研磨。磨碎后离心，速度和时间分别设定为5 000 r/min、10 min。将菌体的下层的沉淀物转移至5 mL 刻度离心管中，加入2 mL 裂解酶及适量渗透稳定剂，静置酶解。记录数据，便于以后统计数据。将菌体溶于两倍体积的渗透压稳定剂中，加入细胞壁降解酶或细胞壁降解酶组合，使其终浓度分别为10 mg/mL、20 mg/mL和40 mg/mL。置于28 ℃振荡酶解3 h 后，用20 mm 孔径的滤膜过滤经酶解处理菌体，取滤液，用血球计数板计算原生质体的浓度。

3 结果与分析

根据试验结果，可以得出不同浓度的组合酶对原生质体形成的作用效果不同的结论。分别观察用5 mg/mL 纤维素酶+5 mg/mL 蜗牛酶、10 mg/mL 纤维素酶+10 mg/mL 蜗牛酶、20 mg/mL 纤维素酶+20 mg/mL蜗牛酶、30 mg/mL 纤维素酶+30 mg/mL 蜗牛酶处理的玉米大斑病菌原生质体在电镜下的状态。

试验结果表明，在26 ℃下，以20 mg/mL 纤维素酶+20 mg/mL 蜗牛酶组成的混合酶酶解3 h。试验从菌体菌龄、温度、酶解时间、酶的种类及浓度、渗透压稳定剂及浓度的影响，对玉米大斑病菌高效原生质体产出的数量进行统计。20 mg/mL 纤维素酶和20 mg/mL 蜗牛酶的组合酶，在26 ℃时利用CM 培养基培养，可以得到数量级为1×106的玉米大斑病菌高效原生质体。本试验还发现，以0.8 mol/L 甘露醇作为渗透压稳定剂，加入20 mg/mL 纤维素酶+20 mg/mL 蜗牛酶的混合酶，有助于裂解酶裂解细胞壁。

4 结论与讨论

4.1 酶的种类及浓度对于产出玉米大斑病菌原生质体的影响

26 ℃条件下，以0.8 mol/L 甘露醇作为渗稳剂，选用纤维素酶、蜗牛酶两种酶的等量混合物来检测检验不同生物酶系统对玉米大斑病菌高效原生质体产出率高低的影响。裂解酶种类及浓度与产出的玉米大斑病菌的高效原生质体个数情况如下：5 mg/mL 纤维素酶+5 mg/mL蜗牛酶产生的高效原生质体数量为6.7×106个，10 mg/mL 纤维素酶+10 mg/mL 蜗牛酶产生的高效原生质体的数量为7.0×106个，20mg/mL纤维素酶+20mg/mL蜗牛酶产生的高效原生质体的数量为7.4×106个，30 mg/mL 纤维素酶+30 mg/mL 蜗牛酶产生的高效原生质体的数量为6.0×106个。

4.2 不同培养基对于原生质体培养效果的影响

培养基影响原生质体的分离效率。依次列出不同的酶组合在不同培养基下的数据结果：5 mg/mL 纤维素酶+5 mg/mL 蜗牛酶分离效率为48%，10 mg/mL 纤维素酶+10 mg/mL 蜗牛酶分离效率为56%，20 mg/mL 纤维素酶+20 mg/mL 蜗牛酶分离效率为50%，30 mg/mL纤维素酶+30 mg/mL 蜗牛酶分离效率为54%。

4.3 酶解时间对于玉米大斑病菌高效原生质体产出的影响

纤维素酶和蜗牛酶的混合酶溶液在26 ℃条件下处理玉米大斑病原体细菌，酶解时间对等离子体系统效应在1～2 h 观察玉米大菌斑的细菌原生质体数量变化不显著；从3 h 开始，原生质体突然达到大约1×106数量级，然后逐渐趋于稳定；4～7 h 玉米大菌斑的细菌原生质体数量一直保持相对稳定的状态；7 h 后观察可见原生质体已经开始逐渐萎缩，逐步减少数量，显示大菌斑细菌原生质体的玉米已经开始死亡。因此，最适酶解时间为3 h。

4.4 温度对各种酶以及组合酶影响的比较

用20 mg/mL 纤维素酶和20 mg/mL 蜗牛酶的组合的混合酶液试验。试验设置了4 个温度梯度，即23 ℃、26 ℃、33 ℃、37 ℃。数据表明，23 ℃时，原生质体的数量级为1×102；26 ℃时达到高峰，为1×106；33 ℃时逐渐下降，为1×104；37 ℃时开始凋亡，又回到1×103。

4.5 渗透压稳定剂对于高效原生质体制备的影响

分别选择不同的浓度梯度（STC）解决方案和氯化钠溶液、甘露醇、山梨醇溶液和MgSO4+磷酸缓冲溶液、渗透压稳定剂在26 ℃和20 mg/mL 纤维素酶+20 mg/mL蜗牛酶的混合酶处理细菌。分析比较不同渗透压稳定剂的原生质体产量和尺寸，0.8 mol/L 甘露醇作稳定剂产生的原生质体数量最大、质量最好，能够达到1×106数量级。

4.6 对菌龄的调查研究

菌龄长短是影响原生质体产生时间的关键因素。对比发现，菌体较为幼嫩有利于原生质体的释放，如果玉米大斑病菌的菌体培养时间过长，导致细胞老化不易被酶解，从而导致试验失败；时间过短则菌体量不够，也不是制备玉米大斑病菌的原生质体的最佳时间。同时发现，如果纯化得到的菌体量过少，在试验中菌体研磨程度不好，会影响试验结果。

4.7 结论分析

本试验表明，在26 ℃条件下，以20 mg/mL 纤维素酶和20 mg/mL 蜗牛酶的组合混合酶液处理玉米大斑病菌，利用0.8 mol/L 甘露醇作为渗透压稳定剂在CM培养基下酶解3 h，将高效得到玉米大斑病菌的原生质体。