PD-1/ PD-L1 免疫哨卡介导的免疫调节在类风湿性关节炎中的研究进展

刘 璐 徐院生 黄伟谦 陈建民 刘国印

中国人民解放军东部战区总医院秦淮医疗区骨科，江苏南京 210002

类风湿关节炎（rheumatoid arthritis，RA）是一种以多关节滑膜炎症和血管翳形成为主要病理改变、以多发性和对称性关节侵袭性炎症为主要临床表现的自身免疫性疾病[1]。随着炎症浸润增加，关节软骨和骨组织发生不可逆性破坏，如果治疗不及时，20%～30%的RA 患者在2～3 年内可导致关节畸形和功能丧失[2]。因此，寻找针对发病原因及其形成机制的治疗策略和新的干预靶点具有深远的意义。尽管RA 的发病原因和机制目前尚未完全被阐明，但已明确免疫系统紊乱引起的T 细胞功能失调是其发生和发展的主要原因。免疫细胞影响RA 病情活动和进展的各个阶段，重视免疫细胞的免疫调节研究有助于拓展对RA 疾病更加全面的认识并为探索RA 的治疗提供参考。

近些年，针对免疫哨卡的相关研究得到了飞速发展，已成为靶向治疗较为成功的领域及研发的热点。细胞毒性T 细胞抗原-4（cytotoxic T cell antigen-4，CTLA-4）和程序性死亡受体-1（programmed death receptor-1，PD-1）/程序性死亡配体-1（programmed death ligand-1，PD-L1）是目前研究的热点分子，被认为是免疫调节的主要信号通路[3]。PD-1 单克隆抗体一直都是肿瘤免疫治疗的研究热点，已成为药物研发及医药巨头竞争的前沿阵地[3]。PD-1/PD-L1 相关药物的相继出现，标志着免疫治疗新时代的开始。临床试验表明[3]，基于PD-1/PD-L1 的靶向制剂在免疫治疗中拥有较好的疗效性及安全性，显示出了令人瞩目的进展和希望。

1 PD-1/PD-L1 免疫哨卡的免疫调节作用

免疫哨卡是自身免疫系统中存在的免疫调节信号，也是共刺激或共抑制信号转换的开关，可调控免疫细胞应答反应的幅度及持续时间[4]。免疫哨卡不仅参与调控免疫系统的动态平衡，维持免疫耐受，从而有效避免恶性肿瘤、自身免疫性疾病及慢性病毒感染等疾病的发生；此外，还通过调控外周组织中免疫应答的强度，阻断病变细胞逃避免疫系统破坏，从而缓解自身免疫异常造成的机体损伤[4]。机体免疫应答过程中，T 细胞扮演适应性免疫的发生中心[4]。PD-1/PD-Ls 免疫哨卡的调控决定T 细胞的发展和未来，即被抗原异常激活转化为效应细胞，从而引发各种疾病的病情进展；或被抑制转为无反应细胞或免疫耐受甚至引起衰竭和凋亡。

PD-L1 在正常组织中不表达或表达很少，健康人群中PD-L1 与PD-1 结合，抑制T 细胞激活，避免细胞过度激活而引起自身免疫性疾病。PD-1/PD-L1 的异常表达对免疫失调性疾病的病情进展具有重要作用，且其表达水平与病理特征及其预后相关。在淋巴器官内，PD-L1 与初始T 细胞相互作用引起T 细胞免疫耐受及其细胞功能降低。由此可见，PD-1/PD-L1 免疫哨卡是参与自身免疫性疾病免疫耐受的重要分子。

2 靶向干预PD-1/PD-L1 在免疫治疗中的作用

肿瘤、病毒感染和病原体感染严重威胁人类健康，随着分子生物学、病毒学、免疫学及肿瘤等各学科间发展的相互交叉、相互渗透，针对PD-1/PD-L1 的靶向疗法为这些疾病开辟新的治疗方法并带来希望[4]。研究表明[5-7]，PD-1 在肿瘤、病原体和病毒感染、结核病及脓毒血症所引起的免疫抑制过程中起着非常重要的作用，这些致病因素可通过上调PD-1/PD-L1 来调节效应细胞的功能及其免疫反应，进而介导免疫逃逸，引起病情的迁延不愈或加重恶化。体内及体外研究均发现PD-1 敲除或抗PD-1 抗体可明显逆转T 细胞功能衰竭，维持并增强T 细胞功能，从而改善其预后。同时，阻断PD-1/PD-L1 的药物已在临床应用于黑色素瘤、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、乳腺癌、肾细胞癌、结直肠癌、皮肤鳞状细胞癌及血液系统肿瘤等恶性肿瘤的治疗中，并获得良好的效果。PD-1/PD-L1在器官移植排斥反应、创伤后免疫功能障碍、狼疮性肾炎、扩张型心肌病、糖尿病、系统性红斑狼疮及免疫脑脊髓膜炎、慢性乙型肝炎等免疫失调性疾病中也有着重要的免疫调节作用[4,8-11]。Zajac 等[12]首先发现T 细胞耗竭存在于人类免疫缺陷病毒感染、慢性乙型肝炎和丙型肝炎病毒感染人群中。随后研究发现[13-15]，阻断PD-1/PD-L1 能增强慢性病毒传染性疾病患者的免疫细胞功能，逆转T 细胞耗竭，降低病毒载量，减少机会性感染。多种急慢性感染性疾病中（病毒、真菌、细菌及寄生虫感染）也观察到与肿瘤和慢性病毒传染性疾病相似的免疫细胞耗竭[16-17]，通过阻断PD-1/PD-L1发现，免疫细胞凋亡明显减少及病原体清除能力增加。结核病患者中也同样发现免疫细胞耗竭现象，且阻断PD-1/PD-L1 引起的免疫激活效应在清除结核感染过程中发挥重要作用[18-20]。

基于以上结论认为，PD-1/PD-L1 是参与免疫耐受、肿瘤和病毒免疫逃逸的重要分子。针对PD-1/PD-L1 的干预治疗在肿瘤、急慢性感染性疾病、慢性病毒传染性疾病和结核病中能够达到平衡免疫细胞功能，避免病变细胞的免疫逃避，提高初始T 细胞的再次激活和CTL 的“连续杀戮”性能，从而提高其抗原的免疫反应，最终达到缓解和治疗的作用。PD-1/PD-L1 的相关研究引领了科研领域的较大突破，获得广泛的认可和关注，已成为靶向治疗较为成功的领域及研究的热点，然而，PD-1/PD-L1 在RA 领域的研究则是刚刚崭露头角[21]。

3 PD-1/PD-L1 在RA 中的作用机制存在分歧

研究发现[22]，PD-1 功能受抑或缺失可导致自身免疫性疾病病情的变化，PD-1 在RA 血清及其病变组织中的T 细胞上持续高表达。然而，在RA 的不同病情进展阶段均存在表达PD-1 的活化T 细胞和CTL，这些细胞不受PD-1 的负性免疫调节，因此，PD-1+介导的免疫逃逸及耐受的机制仍待解决。当抗原清除，免疫应答反应结束后，T 细胞的PD-1 表达明显减少。然而，PD-1 在病变细胞中的高表达会进一步加重病变细胞的衰竭。研究发现[21]，PD-1/PD-L1 抑制免疫应答的初始与效应阶段，维持机体的免疫自稳，否则过强的免疫应答反应将导致自身免疫性疾病的发生发展。研究表明[22]，阻断PD-1 或PD-L1 均可导致糖尿病病情加速或恶化并伴随T 细胞分泌炎症因子的增加；阻断PD-1 或PD-L1 较没有进行免疫治疗的移植物抗宿主患者其生存期明显延长；PD-1 基因敲除小鼠可引发RA、1 型糖尿病、狼疮性肾炎、扩张型心肌病及免疫脑脊髓膜炎。该现象提示，PD-1/PD-L1 与自身免疫性疾病的活动和病情进展存在一定的关系。

既往研究发现[21]，PD-1 异构体可能是造成自身反应性T 细胞异常活化和RA 病情变化的重要因素。可溶性PD-1（sPD-1）可通过上调辅助性T 细胞（helper T cell，Th1）/Th17 T 细胞亚群促进小鼠RA 的免疫病理进程[23]。但进一步研究发现，PD-1 和PD-Ls除膜结合型外还存在可溶性形式sPD-1 和sPD-Ls，即sPD-1 和sPD-Ls 只是PD-1 和PD-Ls 的另外一种存在形式[23]。研究报道[24]，将sPD-1 和sPD-L1 与CD4+T细胞和CD8+T 细胞共培养可引起T 细胞凋亡；而阻断PD-1/PD-L1 可降低sPD-L1 的表达，部分恢复T 细胞的生物学功能。与之相反，另外一篇文献报道[25]，sPD-1 和sPD-L1 的表达在RA 血清和关节液中显著升高，而将sPD-1 和sPD-L1 与自体关节液中的单核细胞与纯化的CD4+T 细胞共培养会增强CD4+T 细胞的增殖，提示，在RA 的免疫机制中，sPD-1 和sPD-L1是依赖PD-1/PD-L1 发挥免疫作用的，且sPD-1 和sPD-L1 对PD-1/PD-L1 及对RA 病情发展的作用目前仍存在较大争议。

4 PD-1/PD-L1 靶向治疗的潜力和未来发展方向

针对免疫哨卡的肿瘤免疫治疗虽然避免了传统药物的毒性及其严重副作用并取得较为满意的临床疗效，但仍存在一些问题亟待解决。研究发现[26-27]，13 例肿瘤患者在接受ipilimumab 或nivolumab 单独治疗或联合治疗时，9 例患者出现了类似RA 的症状，其中2 例接受氨甲蝶呤和抗肿瘤坏死因子的抗风湿治疗，提示，PD-1/PD-L1 抑制剂在治疗肿瘤时发生自身免疫性关节疾病与组织疾病的风险高于正常，症状可严重并持久。然而，PD-1/PD-L1 抑制剂对正常人、骨性关节炎（osteoarthritis，OA）和RA 患者免疫细胞的作用及分子机制尚不明确。由于RA 等自身免疫性疾病和OA 的发病率很高，很多肿瘤患者也可合并自身免疫性疾病或OA，因此明确PD-1/ PD-L1 对自身免疫性疾病和OA 的影响显得尤为重要，以期为PD-1/PD-L1 免疫哨卡相关抗肿瘤、抗病毒和抗感染药物的临床应用安全性提供理论支持。

PD-1/PD-L1 通过调节T 细胞活化进程中的第二信号强度，参与调控免疫应答耐受，并在RA 病情进展过程中发挥重要保护作用，但同时病原微生物则利用该免疫哨卡向淋巴细胞传递抑制信号，引起免疫细胞功能耗竭，导致持续扩散和逃逸。由此可见，PD-1/PD-L1 视机体免疫状态的严重程度而被激活或被抑制，同时在RA 发生和发展中发挥不同的作用及机制。PD-1/PD-L1 在机体中的整体功能意义及其在RA 病情进展中的作用已逐渐引起人们的重视，仍需进一步的研究和探讨，能否通过PD-1/PD-L1 来调节自身免疫状态，进而治疗RA，成为当前研究的热点。

5 PD-1/PD-L1 在RA 病情变化中的作用机制

PD-1/PD-L1 等免疫哨卡视机体免疫状态和炎症程度的不同（即RA 病情活动或进展的不同）而发挥不同的作用。至于究竟何时以负反馈为主，何时以免疫应答反应为主，目前尚不为人所知；在RA 活动期和进展期表达大量的PD-1/PD-L1，同时在RA 患者的静止期和缓解期中，也同样维持高表达状态，理论上来说，PD-1/PD-L1 可以通过负向免疫调控作用来阻止RA 的进一步加重，但事实却是RA 病情一路进展恶化，毫无缓解的征兆。因此，上述现象无法用经典的负向调馈理论给出解释。综合最新研究进展，归纳总结如下：在RA 静止期和稳定期，机体外来抗原被清除（严重强烈的炎症反应被有所抑制和缓解），此时，免疫细胞针对炎症反应和炎症细胞的免疫应答结束或被削弱，免疫细胞停止分泌PD-1/PD-L1 等免疫哨卡，免疫哨卡针对炎症反应和炎症细胞的负反馈机制和负向免疫调控作用减弱，但此时自身的PD-1/PD-L1 仍处于很高的水平。高表达和/或持续表达的免疫哨卡会反过来对免疫细胞传递负性调控信号，诱导T 细胞等病变细胞的免疫耐受和功能降低、免疫无能、功能衰竭甚至凋亡，进而引起特异性的免疫细胞耗竭，促使这些病变细胞应付外来抗原刺激的免疫耐受能力下降，扰乱正常的免疫耐受平衡（即“免疫不应答”），促使免疫细胞难以发挥有效的免疫应答反应，从而使得病变细胞逃避免疫监控和杀伤，削弱机体对炎症反应的清除，难以发挥清除炎症反应的作用，进而缓慢、持续地加重RA 炎症反应。在RA 活动期和进展期，机体承受严重的炎症反应刺激，炎症细胞活化的数量也大幅度增多，代偿性引起免疫细胞活性增加，分泌大量的PD-1/PD-L1，从而对活化的病变细胞和炎症反应发挥负反馈和负向免疫调节作用，从而防止病情的加重和恶化，以减少对机体的损害；当炎症反应增强并维持在一定范围内，RA 病情进入病程的静止期和缓解期，此时免疫细胞上PD-1/PD-L1 等免疫哨卡的表达会较前相应减少，活化的免疫细胞数量逐渐减少，这时候高表达和/或持续表达的PD-1/PD-L1 又开始反过来负性调控免疫细胞，从而进入一个恶性循环，最终加重OA 病情的进展。因此，在RA静止期和缓解期，是以PD-1/PD-L1 等免疫哨卡削弱免疫细胞的免疫应答反应为主；而在活动期和进展期，则是以免疫细胞自身分泌PD-1/PD-L1 等免疫哨卡削弱炎症反应和激活的炎症细胞为主。

6 小结

当前，已有的经过实践检验的关于RA 的理论（即已确定的理论），尚无法解释RA 的发病机制及其病情变化的客观问题，而PD-1/PD-L1 等负向免疫调节因子与RA 在某种程度上与已确定的理论矛盾，构成某种程度的相互否定，一直以来临床和基础研究人员就面临此类问题。综合最新研究进展，本文给出了初步解释，将PD-1/PD-L1 诱导RA 的机制总结如下：免疫细胞（主要是T 细胞）在RA 关节液、血清及其滑膜组织中高表达PD-1 和PD-L1；同时，在RA 不同活动和不同进展阶段，均存在高表达PD-1 的活化免疫细胞，发挥负向免疫调节作用，从而防止病情的加重。在RA 静止期和稳定期时，抗原清除，免疫应答结束，病变细胞PD-1/PD-L1 的表达较前减少，但仍处于较高的状态。持续和/或高表达的PD-1/PD-L1可诱导免疫细胞功能受损甚至衰竭，促使病变细胞应对免疫耐受的能力下降，正常的免疫耐受平衡被破坏。随着RA 病情进展及活动期和静止期的反复变化，PD-1/PD-L1 的表达一直维持在高表达状态，持续和/或高表达的PD-1/PD-L1→免疫细胞功能受损或衰竭→免疫耐受和免疫平衡紊乱→免疫应答反应增强→RA 的迁延、进展和恶化。因此，PD-1/PD-L1 有望成为RA 的重要治疗靶点和综合诊疗中的重要组成部分，以期为RA 的防治提供新的思路。远期需要更多的动物模型、临床试验及细胞分子生物学实验来验证该发病机制，继续深入研究PD-1/PD-L1 在RA发生和发展中的作用，有可能真正揭开RA 病情演变的奥秘，为RA 的防治拓展新的思路。