椎间盘纤维环生物学修复的研究进展

杨俊辉，姜成 综述 黄春明，李小川，3 审校

1.广东医科大学，广东 湛江 524000；2.广东医科大学附属高州医院，广东 高州 525000；3.高州市人民医院博士后创新实践基地，广东高州 525200

随着社会老龄化的发展，椎间盘退行性疾病(intervertebral disc degenaration，IVDD)的发病率也逐年递增[1]。据统计，全世界大约有4/5的人在其一生中至少经历过一次严重的下腰痛，而IVDD是导致下腰痛的主要原因之一[2]。尽管腰痛很少危及生命，但每年因腰痛所带来的身体残疾、医疗费用等经济损失巨大[3]。

椎间盘由中央的髓核(nucleus pulposus，NP)和周围包饶的纤维环(annulus fibrosus，AF)构成，与相邻椎体、椎旁肌和韧带等组织一起，维持脊柱静息及运动状态的稳定[4]。众所周知，纤维环损伤是导致椎间盘术后疗效不佳的重要因素，包括长期腰背疼痛、椎间盘退变持续加重和椎间盘突出复发等。研究表明，椎间盘切除术后突出复发或疼痛的概率为5%～25%[5]。因此，恢复纤维环结构和功能的完整性，对腰痛症状的缓解、降低椎间盘突出复发率等都具有重要意义。由于纤维环是一个相对封闭的无血管组织，其自我修复能力有限，外科干预往往很难达到理想的修复效果，因此探索新型纤维环生物修复疗法逐渐成为研究热点。纤维环损伤的生物学修复通常指用生物材料或生物反应调节剂，如使用基因、细胞、组织工程等，通过基因治疗、细胞移植、组织工程构建等方法促进纤维环及其基质再生，恢复其生物力学特点，从而修复受损的椎间盘。为此，本文综述了目前纤维环修复与再生治疗的研究进展，以期为今后的研究方向选择提供帮助。

1 纤维环的解剖与生理

1.1 纤维环的结构和组成 人体纤维环是一种无血管结构，由15～25个同心层组成，每层纤维环间呈60°夹角斜行排列[6]，具有较强的抗牵拉性与抗压缩性，同时能防止髓核向外突出。其大致可分为内、外两层，由内到外，蛋白多糖和Ⅱ型胶原的含量逐渐降低[7-8]。总之，纤维环独特的组成和结构对于维持椎间盘的各向异性、弹性机械载荷以及维持内环境稳定至关重要。

1.2 纤维环的损伤机制 目前认为纤维环的损伤机制主要包括3个方面：长期或过高的机械负荷导致椎间盘内压增高并使纤维环变形；异常蛋白水解酶活性增加导致纤维环细胞外基质的代谢失衡；以及纤维环营养物质的供给障碍。另外，包括细胞内损伤、氧化应激、异常细胞反应造成的损伤以及pH 值变化[9-10]等，也可诱导或加速纤维环细胞的凋亡。

1.3 纤维环损伤致椎间盘退行性病变的机制 椎间盘退变的具体机制目前尚未明确，其发生发展与年龄、遗传、环境、损伤等多种因素相关。而纤维环受应力损伤后导致的纤维环破裂、髓核突出[11]是导致其退变的重要因素之一。在急性损伤或慢性应激的情况下，受损的纤维环发生微断裂，使髓核从薄弱的环形裂隙处突出；同时在受损部位形成强烈的炎症反应，导致细胞凋亡和椎间盘细胞外基质的代谢失衡，促进椎间盘退变的发生。此外，纤维环损伤后其完整性遭到破坏，从而改变了椎间盘内的静水压，使椎间盘生物力学性能发生改变，其强度和抗压缩性均不同程度降低，不断加重椎间盘的退变[12]。

2 纤维环的修复策略

2.1 纤维环缝合、封堵技术 为了恢复椎间盘的正常功能，人们做了许多关于纤维环修复策略方面的尝试。最近，一些纤维环修复的缝合系统及植入式设备已经上市，如AnchorKnotTM和BarricaidTM系统。AnchorKnotTM系统[13]是用缝线来闭合纤维环缺损，以防止髓核进一步突出。BarricaidTM系统[14]的修复方式于2019 年获得FDA 批准，其作为一种植入装置，插入损伤椎间盘附近椎体以形成一个聚酯纤维网屏障。其后续随机临床试验表明2 年内的症状再发率有所降低，但致终板改变的发生率较高[15-16]。这表明该器械的长期疗效和安全性，尤其是在器械固定期间椎体和软骨终板的变化方面，仍有待确定。传统的纤维环的修复方式仅实现物理修复，主要是对纤维环损伤部位的缝合、修补、封堵等，并不是理想的修复策略[17]。现有的外科治疗手段已被证明只能在手术后短期内缓解症状和维持脊柱稳定性，长期随访发现大部分外科手术患者手术邻近椎间盘会相继出现退行性变和生物力学特性改变。目前单独应用于纤维环损伤的生物学修复技术还未应用于临床，但许多在大动物模型的体内实验表明，使用生物学修复策略治疗后的椎间盘能够恢复到同健康椎间盘最大承受内压的2/3[18]，具备较好的生物力学性能。此外，一项使用细胞移植自体骨髓间充质干细胞(MSC)治疗椎间盘退化后1年的临床进展随访发现，其疼痛、残疾状况和生活质量较外科干预患者短期改善效果更为有利[19]。各项研究都表明，利用生物学修复策略来促进纤维环以及邻近椎间盘的再生长，较传统修复方式更为安全有效。

2.2 纤维环修复的生物学治疗 由纤维环损伤引起的椎间盘退变是非常普遍的，通过修复受损的纤维环可预防或治疗IVDD。然而，由于纤维环的内源性愈合能力较差，难以依靠自我修复达到治疗的目的。因此，研究椎间盘纤维环再生的生物学治疗是一个亟待解决的问题。椎间盘纤维环的生物疗法可以分为3大类：基于细胞移植的治疗，材料学为主的组织工程治疗，以及改变内源性基因表达和功能的基因治疗，在近来的相关研究中展现了具有潜力的治疗前景[20]。

2.2.1 细胞疗法 细胞治疗是通过植入、替换损伤和凋亡的细胞，促进椎间盘中的细胞再生以提高纤维环中的活细胞量[21]，是纤维环修复的理想方法。目前细胞疗法最理想的种子细胞还没有定论，可能的细胞来源包括从椎间盘提取的自体软骨细胞、椎间盘细胞和干细胞。由于自体软骨细胞与纤维环细胞有相似的细胞表型[22]，可用于纤维环细胞治疗，但由于蛋白多糖与胶原的比例低于椎间盘细胞，可能不是细胞移植治疗的最佳来源。研究发现，自体纤维环细胞可能是纤维环修复理想的细胞来源[23]，但由于临床取材困难，而且其细胞密度较低，严重限制了其应用价值。间充质干细胞(MSC)在不同环境下可分化为特定细胞，作为种子细胞具有较大优势，体内实验表明，同种异体干细胞在纤维环和髓核的修复中均显示了有意义的作用[24]。但这一方法目前尚处实验阶段，实现细胞的定向分化和应用产生的伦理问题仍有待解决。

2.2.2 组织工程 组织工程修复纤维环技术的基本思路是将种子细胞与纤维环修复支架共培养后植入纤维环破口，借助植入细胞的再生长使纤维环破口得到生物学修复[25]。纤维环组织工程的种子细胞主要是纤维环细胞和MSC等。目前诸多国内外学者己成功通过静电纺丝、冷冻干燥、湿纺等技术构建多种纤维环支架。最近的研究表明，电纺角层结构和胶原凝胶复合材料能够部分复制或模拟纤维环组织的结构[26-27]。但弹性性能缺失及稳定性是亟待解决的问题。3D生物打印支架成为解决稳定性问题的新选择[28]，但主要缺点是当前的3D修复纤维环方法无法形成维持纤维环细胞黏附和表型的纤维形态。缺乏合适的打印材料[29]以及纤维环组织结构、功能实现的复杂性，是组织工程在纤维环修复临床应用上所面临的挑战之一。此外，选择适合的生物活性因子来模拟自然纤维环的生存环境，从而诱导种子细胞的分化和维持细胞表型[30]，创造有利于纤维环细胞修复和再生的环境是另一关键。有研究发现，生长分化因子(GDF)-5、结缔组织生长因子(CTGF)和转化生长因子(TGF)-β3有助于干细胞向纤维环细胞的生长分化[31-33]，相关研究虽然证实在体外实验中纤维环支架的有效性，但缺少动物实验证明该支架在椎间盘特殊的微环境中能否发挥功能。此外，相关研究表明，富含血小板血浆(PRP)可作为促进生物椎间盘修复的潜在治疗候选者[34]，具有良好的应用前景。然而，生物活性因子的剂量、制备方法和作用机制等尚未形成共识，仍有待进一步研究。

2.2.3 基因治疗 基因治疗是将目的基因通过病毒或非病毒载体转入细胞并表达特定的基因或蛋白，从而实现对疾病的治疗或预防[35]。其相对长期的治疗效果对治疗缓慢进展的椎间盘退化具有潜在优势。在基因治疗中，靶基因的选择和载体至关重要。在纤维环损伤的基因治疗方面，目前最常用的是病毒载体，比如利用慢病毒载体转染shRNA来抑制C/EBP同源蛋白的表达，阻止纤维环细胞的凋亡[36]。而腺相关病毒载体因其较少的免疫原性和非致病性而被广泛应用。XI等[37]通过腺相关病毒转染的rAAV-hVEGF165和AAV-TGF-β1共培养证明hVEGF165联合TGF-β1可协同促进退变椎间盘纤维环细胞I型胶原蛋白的表达，能促进受损纤维环的修复。

虽然基因治疗最初主要是通过病毒载体介导的，但技术进步使得包括微泡增强超声技术、RNA 干扰、多链胶束和CRISPR/Cas9 等非病毒基因治疗应用于椎间盘成为可能[38]。CAMBRIA 等[39]报道了在体外通过CRISPR/Cas9 基因编辑系统成功敲除了瞬变感受器电位蛋白V4(TRPV4)基因，从而抑制了纤维环损伤中的炎症反应，有望成为治疗纤维环损伤引起的慢性腰痛的新技术。另外，MASAAKI 等[40]的研究表明，mTOR信号通路参与了兔纤维环细胞的增殖和代谢周期的调节，相关调节蛋白或基因可作为基因治疗的潜在靶点。非病毒基因治疗可以减少病毒基因治疗带来的致突变性和病毒感染的风险，避免了病毒基因治疗的许多局限性，为基因治疗的应用带来新的可能。但是，成本高昂、转染率低和靶向性差是非病毒基因治疗应用所面临的挑战。

3 展望

生理情况下，纤维环的自我修复能力微弱而缓慢，通过生物学修复的方法有助于恢复纤维环结构和功能的完整性，这对于缓解甚至逆转IVDD 有重要意义。对于轻度和中度IVDD，通过细胞移植可能是一种有效的治疗方法。然而，对于需要结构支持的严重IVDD，通过组织工程可以更好地实现多功能治疗。同时，基因治疗相对长期的疗效在治疗缓慢进展的椎间盘退化方面具有潜在的优势。虽然目前纤维环生物学修复的相关研究已经取得了可喜的进展，但这些修复方法尚未超越临床前动物实验阶段，同时这些技术在恢复椎间盘生物力学上的长期效能仍有待证实。此外，更好的种子细胞来源、组织工程材料的选择、靶基因的构建以及良好的生物相容性，在保证纤维环强度的同时恢复椎间盘力学结构的完整性等关键难题尚未解决。如能解决这些问题，细胞移植、基因治疗、纤维环组织工程构建等新方法将在椎间盘纤维环修复领域将发挥重要作用，成为椎间盘退行性疾病治疗的新方向。